07 Mar Factores Biológicos: repercusión en los resultados experimentales
Factores biológicos: repercusión sobre los resultados experimentales
J.C. Illera, P. Millán, M.M. Martínez-Mateos, A. González-Gil, M.J. Illera, P.L. Lorenzo, L. Revuelta, G. Silvan.
Introducción
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Figura 1. Factores que pueden influir en los resultados experimentales. |
La utilización de los animales como modelos experimentales ha sido una de las principales vías mediante la cual los investigadores han contribuido a nuestros actuales conocimientos de los fenómenos biológicos. La experimentación animal también ha contribuido al avance de la tecnología para la producción y el mantenimiento de nuevas cepas (líneas) de animales necesarias para estos estudios.
Las mejoras en los instalaciones y cuidado de los animales han disminuido la incidencia de enfermedades en los mismos.
Cada vez se le da más importancia a la influencia que los factores ambientales ejercen sobre la experimentación animal y los investigadores demandan animales con unas características y condiciones definidas para asegurar la repetibilidad de los resultados experimentales (Morgan, 1978).
Además, no sólo los factores ambientales, pueden ejercer una influencia decisiva sobre los resultados obtenidos en los experimentos en los que se utilizan animales, sino que a estos hay que sumarles una serie de factores biológicos. Estas influencias han comenzado a ser tenidas en cuenta por los Científicos, a la hora de planificar una protocolo experimental.
Los posibles factores que pueden afectar y complicar los resultados experimentales que se esperan obtener con la utilización de modelos animales, pueden ser clasificados en (Figura 1):
a) físicos,
b) químicos,
c) microbiológicos, y
d) fisiológicos.
Factores físicos
Entre los factores físicos cabe señalar el entorno y el estrés.
Entorno
Numerosos factores del entorno pueden afectar la respuesta biológica de los animales. Entre estos factores están incluidos el macroambiente (temperatura, humedad, luz y renovaciones de aire) y el microambiente (espacio por animal, tipos de lecho, higiene y producción de gases).
Estrés
Se ha comprobado que el estrés, experimental o no, puede tener relevantes consecuencias fisiológicas en la investigación alterando los resultados obtenidos.
Factores químicos
La contaminación química del ambiente o del entorno como por ejemplo, la producción de amoniaco, los desinfectantes ambientales y los pesticidas, la composición del agua y del alimento y la utilización de agentes farmacológicos, como por ejemplo: anestésicos, analgésicos, antihelmínticos, antibióticos, etc, puede alterar las respuestas fisiológicas de los modelos animales utilizados en la experimentación.
Factores microbiológicos
Como es bien sabido un gran número de patógenos podría afectar los resultados de los estudios in vivo como por ejemplo: virus y micoplasmas de roedores, enfermedades bacterianas, parásitos, etc pueden interferir en la resultados experimentales causando enfermedades clínicas, lesiones e incluso la muerte de los animales.
Factores fisiológicos
Vamos a centrarnos sobre las variables fisiológicas que pueden influir en los resultados experimentales esperados, en los modelos animales utilizados en investigación. Estas variables podrían clasificarse como:
1. Determinantes Biológicos.
2. Funciones Metabólicas.
3. Ritmos Biológicos.
Determinantes biológicos y funciones metabólicas
Dentro de los Determinantes Biológicos y las Funciones Metabólicas centraremos nuestra atención sobre: la especie animal, la cepa, el sexo y una serie de variables que hemos clasificado como factores generales.
Especie animal
La selección de la especie animal en el momento de planificar el protocolo de la experimentación es crítica, porque debemos tener en cuenta que dependiendo del estudio que se vaya a llevar a cabo la respuesta del animal podría ser diferente.
¿Qué es lo primero que deberíamos considerar a la hora de seleccionar la especie animal?. Pensamos que lo primero que se debería tener en cuenta son las características fisiológicas de los animales seleccionados que tendrán que ser las necesarias para alcanzar los objetivos de la investigación propuesta. Por ejemplo, si lo que se va a realizar es una investigación farmacológica con el fin de evaluar o testar un nuevo fármaco, que será utilizado para la especie humana, deberíamos tener en cuenta si la respuesta fisiológica de la especie que hemos seleccionado nos permitirá la extrapolación de los resultados obtenidos a la especie humana.
Un claro ejemplo de lo anterior es la actividad de la especie, es decir, si ésta es diurna o nocturna. Se sabe, que entre otros factores orgánicos, la absorción intestinal, el tono muscular y las actividades cerebral y nerviosa, son muy diferentes entre las horas diurnas y nocturnas.
Centrándonos en la absorción intestinal, si la especie seleccionada presenta actividad nocturna, como por ejemplo los roedores, la absorción intestinal es máxima durante las horas nocturnas. Cuando la experimentación se realiza durante las horas del día, lo más corriente en todos los centros de investigación, los resultados esperados podrían no ser satisfactorios y no extrapolables a las especies diurnas, como es la especie humana.
Una vez que se ha seleccionado la especie animal, deberíamos tener en cuenta asimismo, la variabilidad de los resultados debida a factores sociales. En la naturaleza, las especies animales organizan su población en sistemas sociales, con el fin de conservar los recursos de su entorno y asegurar que, por lo menos, un pequeño grupo de individuos sea capaz de sobrevivir a un periodo de escasez. Estos Sistemas se denominan: Territorio: la defensa de un área y Rango u Orden Social: la ordenación de la población en un orden social (Davis, 1978).
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Figura 2. Concentraciones de testosterona en ratones dependiendo del rango social. |
Una de las causas más frecuentes, que no se tiene en cuenta y que es la responsable de que se produzca la variabilidad fenotípica dentro de una estirpe animal, genotípicamente uniforme, es la variabilidad interindividual creada por las relaciones Dominancia-subordinación, o lo que es lo mismo, el rango u orden social de un grupo de animales criados y alojados juntos dentro de una misma jaula. Cuando estas relaciones sociales cambian, el comportamiento y la fisiología de estos individuos podría verse afectada por estos cambios.
Es muy importante conocer si la especie animal seleccionada presenta rango social. En nuestro departamento (Illera et al., 1991; Martínez-Alesón et al., 1992a), durante los últimos años, se han desarrollado una serie de experimentos cuyo principal objetivo ha sido el estudio en ratones macho alojados en grupo (sistema de alojamiento muy común en la práctica en la mayoría de los laboratorios), sobre el efecto que el rango o la jerarquía social ejerce sobre una serie de parámetros fisiológicos de estos animales (Figura 2).
Como pos ver en la figura, los resultados obtenidos muestran que existen variaciones, estadísticamente significativas, en las concentraciones de testosterona plasmática entre los ratones macho dominantes y subordinados y estos valores son sre mucho más altos en los dominantes respecto a los subordinados. Con ello pos constatar que la respuesta de los individuos de la especie seleccionada va a depender en gran medida del rango social que presente esta especie. Ésta es una de las razones por las que, incluso utilizando grupos muy homogéneos en el protocolo experimental, la respuesta individual del animal puede variar, apareciendo outliers en los resultados, o amplios límites de confianza o errores en estos estudios experimentales, sin que esto suponga que el protocolo de la investigación esté mal planteado.
s podido comprobar incluso la existencia de un rango social similar entre los ratones macho de una misma habitación, pero alojados individualmente, con respecto a sus vecinos (Silván et al., 1992).
En otro experimento realizado bajo estas condiciones, encontramos asimismo y respecto a los niveles plasmáticos de testosterona, diferencias estadísticamente significativas entre los machos de las distintas jaulas. Cuando se sacó el macho dominante de la habitación, comprobamos como el segundo macho dominante dentro de ese rango social que se había establecido, ocupaba su plaza, convirtiéndose en el nuevo macho dominante dentro del rango social de la habitación.
Cepa
El efecto de la cepa o de la variación fenotípica, sobre la respuesta del animal, ha sido poco investigado. Heinecke en 1965, estableció que antes de comenzar un experimento es necesario tener en cuenta tanto la cepa como la línea de los animales que se van a utilizar, ya que al comparar la composición sanguínea de distintas líneas, dentro de una cepa y de cepas independientes, obtuvo mayores diferencias significativas en las primeras.
Se ha comprobado asimismo, que la respuesta a un fármaco puede variar dependiendo de las cepas. Davey en 1962, evaluó la respuesta a los anestésicos de una cepa convencional de ratones albinos y de ratones SPF. La potencia de los anestésicos difería ligeramente entre los dos grupos, pero los ratones SPF eran mucho más resistentes a los efectos letales de los anestésicos, que los animales convencionales.
Existen numerosas diferencias entre cepas, dentro de una misma especie, en los componentes de la flora intestinal, pero no sólo la flora patógena puede afectar las respuestas a los fármacos. Una serie de estudios realizados en animales libres de gérmenes y en animales gnotobióticos, ha strado que el tipo de organismo que porta el animal, puede afectar, no sólo a numerosas características fisiológicas, sino también, las respuestas a los fármacos. Por elo, los cobayas germ-free mostraron una mayor susceptibilidad a la penicilina. Este efecto es debido tanto a los cambios en la flora intestinal como a la sensibilidad inherente de la especie (Newton et al., 1964).
Es muy importante estandarizar las variables fisiológicas, que son inherentes a la cepa que se va a utilizar en la experimentación, ya que es conocido que tanto la hematología y la bioquímica sanguínea como una serie de parámetros endocrinos son diferentes entre las cepas que pertenecen a una misma especie.
Durante los últimos años se han llevado a cabo (Departamento Fisiología Animal, UCM) una serie de estudios en tres cepas de ratones, comúnmente utilizadas en los protocolos experimentales, como son las cepas C3H/He, C57BL/6 y Balb/c. El objetivo principal de estos trabajos fue encontrar posibles variaciones en la producción de hormonas esteroides, evaluando las influencias que tanto la cepa como el tipo de alojamiento (individual o en grupos), podrían ejercer sobre la secreción de estas hormonas. Se midieron las concentraciones plasmáticas de testosterona, encontrando diferencias estadísticamente significativas en los nieles de esta hormona al comparar las tres cepas estudiadas (Figura 3), siendo la cepa C3H/He la que presentaba la mayor concentración plasmática de testosterona.
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Figura 3. Concentraciones de testosterona en ratones dependiendo de la cepa y del tipo de alojamiento. |
Al evaluar si el tipo de alojamiento, individual o en grupos, influía, comprobamos que variaban significativamente las concentraciones plasmáticas de testosterona, comprobando que los animales alojados individualmente siempre poseían una concentración más elevada de esta hormona. Estos resultados sostienen el hecho de que es indispensable realizar la estandarización de las características fisiológicas de la cepa que se haya seleccionado para una experimentación, antes de comenzar la misma.
Lovell realizó en 1986 una serie de estudios, en los que evaluó el tiempo de sueño del pentobarbital en distintas cepas de ratón, comparando también el efecto del anestésico en ambos sexos (Tabla 1). Encontró diferencias altamente significativas entre cepas y por regla general, utilizando la misma dosis, los machos dormían más tiempo que las hembras. Lovell comprobó que la variación en el tiempo de anestesia (sueño) del pentobarbital se relaciona con la variación en el aclaramiento metabólico y no es debida a las diferencias en la sensibilidad del receptor cerebral entre machos y hembras.
Sexo
El estudio realizado por Lovell nos permite conocer otro factor determinante que puede variar los resultados y que debe tenerse en cuenta que es el sexo de los animales.
Por ejemplo, la mayoría de las funciones fisiológicas de las hembras están controladas por la fase de su ciclo estral, más exactamente por las fluctuaciones hormonales que se producen durante estos periodos. Por este motivo, la respuesta experimental puede ser claramente diferente en las hembras que en los machos.
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Tabla 1. Duración de la anestesia originada por el pentotal (en minutos) en tres cepas de ratones.
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La respuesta individual puede ser también diferente cuando sólo se utilizan hembras en un experimento, sobre todo si éstas no están en la misma fase del ciclo estral. Por ello, la sincronización del estro de las hembras antes de comenzar el estudio experimental es necesaria. Si no es posible, por lo menos deberíamos conocer en que fase del ciclo estral se encuentran las hembras. Este hecho es muy importante ya que existen importantes durante las diferentes fases ováricas. En la fase folicular, justo antes de la ovulación, se produce un incremento en los niveles de estrógenos. Este incremento de estrógenos dispara la activación de los mecanismos inductores del estrés con el consiguiente impacto fisiológico que se produce sobre las respuestas y funciones orgánicas. Así, el incremento de los niveles de estrógenos es percibido por la corteza cerebral como punto de comienzo, la secuencia de acontecimientos.
Desde la corteza cerebral los impulsos son conducidos al hipotálamo donde se estimula el sistema nervioso autónomo (Stephens, 1980). La estimulación simpática provoca: 1) una descarga de norepinefrina de las terminaciones nerviosas, que parte entra en la circulación y, 2) los impulsos nerviosos llegan a la médula adrenal y se produce la liberación al torrente circulatorio de epinefrina y norepinefrina de la glándula adrenal. Este incremento en la secreción de catecolaminas puede afectar a las funciones orgánicas, así por ejemplo, el ritmo cardiaco y la fuerza de contracción están incrementados. Si los niveles de estrógenos persisten, es decir el agente estresante persiste, el hipotálamo comienza a secretar factores de liberación de corticotropina (CRF). Éstos alcanzan la hipófisis y se produce la liberación de ACTH, ésta incide en la corteza adrenal y provoca un incremento de la secreción de corticosteroides al torrente circulatorio. Este mecanismo está regulado por un sistema de retrofuncionalidad negativo de tal manera que se para cuando el agente estresante o los niveles de estrógenos no son activos.
Este mecanismo puede explicar las variaciones de los resultados experimentales cuando se utilizan hembras en la fase folicular del ciclo estral. Todos los factores descritos pueden alterar considerablemente la respuesta del animal a cualquier fármaco o manipulación. Los resultados podrían diferir de los obtenidos en los animales en los que no se hayan estimulado completamente los mecanismos de defensa.
La mayoría de las enzimas relacionadas con la degradación de los fármacos y agentes químicos exógenos se encuentran en el hígado y se denominan enzimas microsomales hepáticas (HME). Estas enzimas son claves para el metabolismo de los agentes terapéuticos, tanto conocidos como potenciales y, debido a ello, recientemente han despertado un gran interés en los investigadores. Algunos de ellos, han encontrado que estas enzimas microsomales hepáticas son diferentes entre machos y hembras, tanto cualitativa como cuantitativamente, lo que podría representar un factor determinante para el desarrollo de los protocolos farmacológicos, puesto que: primero, la degradación metabólica o las cinéticas enzimáticas de un determinado compuesto/fármaco serán diferentes entre machos y hembras y, segundo, por lo anteriormente mencionado, los resultados obtenidos sólo podrían ser extrapolados a los machos y no a las hembras (como generalmente se hace), debido a que la respuesta de éstas hacia el compuesto no será la esperada.
Factores generales
Bajo este epígrafe se incluyen aquellas variables que no son inherentes a los factores previamente descritos.
Una de estas variables es la respuesta individual de cada animal al protocolo experimental. Esta es la principal variable que permite explicar la enorme variabilidad que existe entre los resultados esperados y los obtenidos.
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Figura 5. Título de anti-E2 en dos conejos. |
Es bien conocido por todos los investigadores que, para diseñar correctamente un protocolo experimental se debe seleccionar un grupo de animales lo más homogéneo posible. Sin embargo, bajo algunas circunstancias, esto no es suficiente para predecir la obtención de unos resultados experimentales aceptables.
Un ejemplo muy significativo es la variabilidad de la respuesta individual del sistema inmune que se observa en el curso de la producción de anticuerpos, ya que, incluso en el caso de que se haya seleccionado un grupo de conejos muy homogéneo (conejos NZW de 2,5 kg de peso), a éstos se les administre la misma dosis de inmunógeno, se utilice idéntica vía de inoculación (vía intradérmica) y el mismo protocolo de inmunización, la respuesta individual es impredecible.
s podido verificar, en nuestro laboratorio (ver Figura 5), la extda variabilidad existente entre animales, respecto a los títulos de anticuerpos policlonales obtenidos en el curso de la inmunización de conejos NZW frente a distintas hormonas esteroides (Illera et al., 1992a), siendo la respuesta inmune de un animal la esperada, mientras que otro no presentó ningún tipo de respuesta.
Otro factor que puede afectar la respuesta fisiológica de los animales de laboratorio es la coprofagia. No existe ninguna duda que la coprofagia es una característica común a la mayoría de las especies denominadas frecuennte como animales de laboratorio y que ésta puede tener un efecto sobre los resultados experimentales.
Una rata de laboratorio, por elo, puede llegar a ingerir entre el 35 y el 65% de sus heces y se ha comprobado que cuando a los animales se les impide la oportunidad de desarrollar la coprofagia, se produce una disminución del crecimiento (del orden del 15 al 25% de la ganancia neta), debida aparennte al impedimento del consumo de las heces (Kwong et al., 1971). Sin embargo, el impacto real de la coprofagia sobre el metabolismo y el reciclaje de los fármacos no ha sido aún evaluado.
Consideramos que éste es un factor extdamente importante a tener en cuenta, puesto que tanto el metabolismo del fármaco como los parámetros tológicos y bioquímicos del animal cambiarán dependiendo del porcentaje de materia fecal fresca ingerida. La coprofagia es un fenómeno fisiológico que se repite cada día, durante el periodo de oscuridad, siendo un claro elo de ritmicidad fisiológica que afecta también a los resultados de los estudios in vivo.
Ritmos Biológicos
Un ciclo es un patrón que se repite sobre sí mismo continuamente. Muchas de las características de los animales de laboratorio varían regularmente en periodos específicos. Estos fenómenos pueden ser observados no sólo a nivel de todo el organismo, sino también en órganos, tejidos e incluso en células aisladas.
La mayoría de las fluctuaciones diarias de las variables fisiológicas y del comportamiento son realmente endógenas, puesto que persisten incluso cuando no están presentes influencias orales externas. Si se aísla a los individuos de su entorno cíclico habitual estos ritmos persisten como ritmos free-running (ligeramente desviados del periodo de sincronización). Aunque los ritmos están genéticamente codificados, pueden modificarse por el ciclo ambiental y las acciones de los sincronizadores o Zeitgebers (donadores de tiempo como por ejemplo, los ciclos luz/oscuridad).
Halberg introdujo en 1959 el término Ritmos circadianos (circa diem = aproximadamente un día) para referirse a las variaciones endógenas. Los ritmos Biológicos han sido clasificados de acuerdo a su periodo como, ultradianos (<20 horas), circadianos (aproximadamente 24 horas) e infradianos (>28 horas).
Los ritmos infradianos incluyen los circaseptanos (aproximadamente de una semana) que son los típicos del hematocrito, la hemoglobina, los glóbulos rojos y/o el volumen urinario; los circatrigintanos (aproximada-mente 30 días), característicos por ejemplo de la progesterona y el estradiol y, los circanuales (aproximadamente un año), característicos de la mayoría de las hormonas.
El ritmo que ha atraído la mayor atención es el circadiano. La mayoría de las variables fisiológicas, comportamentales y bioquímicas, presentan una periodicidad de 24 horas. En la Tabla 2 se presenta una breve lista de los procesos biológicos que muestran un ritmo circadiano.
La existencia de estos ritmos circadianos debería ser tenida en cuenta por los investigadores para evitar llegar a falsas conclusiones o resultados, se deberían seguir una serie de pasos a la hora de la recogida de muestras.
El paso más importante es la toma de muestras alrededor del reloj es decir a horas o tiempos determinados. Si esto no es posible, las medidas deberían ser obtenidas en el mismo momento del día.
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Tabla 2. Principales procesos biológicos que muestran ritmo circadiano. * Actividad y Temperatura Corporal * Consumo de alimento y agua * Eosinófilos sanguíneos * Presión sanguínea diastólica y sistólica * Síntesis de proteínas hepáticas * Síntesis de DNA y actividad mitótica * Niveles séricos de cortisona * Niveles séricos de lípidos * Metabolismo hepático de fármacos * Tiempo de anestesia: pentobarbital, hexabarbital * Efectividad y toxicidad de fármacos * Susceptibilidad de la leucemia experimental a la quimioterapia * Susceptibilidad de las ratas a las erosiones gástricas * Susceptibilidad a la infección |
Otro paso a tener en cuenta es especificar las condiciones de iluminación y referir los resultados a cuando se enciende la luz (o cuando se apaga) en vez de utilizar el to real (la luz está asociada con la actividad en los animales diurnos y lo contrario en los nocturnos). Portela et al. (1994) encontraron diferencias en las concentraciones de corticosterona entre especies diurnas y nocturnas.
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Figura 6. Ritmo circadiano de la hemoglobina y la creatinina en conejos Nueva Zelanda machos. |
Las variaciones circadianas han sido demostradas en gran número de parámetros hematológicos. Algunas de estas variaciones fisiológicas están detalladas en los siguientes ejemplos.
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Figura 7. Ritmo circadiano de testosterona en gerbillos machos y hembras. |
El primer experimento se realizó en conejos macho de la estirpe blanco de Nueva Zelanda (Illera et al., 1992b). A los animales se les extrajeron muestras de sangre con intervalos de 4 horas. En la Figura 6 están representadas las variaciones circadianas de hemoglobina que muestran un descenso de las concentraciones en las horas de oscuridad. También están representadas las variaciones diarias de la creatinina. Los dos ritmos circadianos presentan un pico durante las horas de luz; como se aprecia, el incremento comienza alrededor de las 4:00 a.m. (antes de encenderse la luz).
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Figura 8. Ritmo circadiano de los eosinófilos sanguíneos de ratón. |
Los niveles hormonales también siguen un patrón circadiano. Un experimento distinto realizado asimismo en nuestro laboratorio mostró que la testosterona plasmática de los gerbillos también sigue un patrón circadiano (Illera et al., 1994), similar al ritmo circadiano del cortisol que ha sido ampliamente estudiado. Se tomaron muestras sanguíneas de 35 gerbillos macho y 35 gerbillos ra (Martínez-Alesón et al., 1992b). Ambos sexos presentan patrones circadianos de testosterona plasmática muy similares, con las concentraciones más elevadas al final del periodo de luz (que se corresponde con el final del periodo de sueño en humanos, véase Figura 7).
En 1960 se demostró la existencia de una variación circadiana en las células sanguíneas de la serie blanca en ratones y hámster (Figura 8), lo que posteriormente ha sido comprobado en muchas otras especies. El número de eosinófilos en el ratón y en el hámster es mayor durante las horas de luz, con una variación de 1.500 eosinófilos/mm3 de sangre, aproximadamente a las 12:00 horas hasta menos de 700 eosinófilos/mm3 de sangre, aproximadamente a las 24:00 horas (resultados determinados en el ratón macho por Halberg et al., 1957).
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Figura 9. Ritmo circadiano de los linfocitos en el perro. |
Como se ha mencionado anteriormente, lo mejor sería recoger las muestras cada pocas horas. Si esto no es (o no ha sido) posible, sería suficiente con especificar la hora exacta a la que las muestras han sido recogidas.
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Figura 10. Ritmo circanual de la albúmina y la globulina en perros. |
Es muy importante especificar no sólo la hora de recogida de muestras, sino también el día, el mes y el año. Continuando con las células sanguíneas de la serie blanca, se ha demostrado que el número de linfocitos varía si la determinación se realiza el mismo día de la semana, pero en distintos meses del año (Figura 9). El número de linfocitos del perro, determinado en enero, es mayor de 6.000 células/mm3 de sangre, mientras que en junio, este número se reduce a menos de 3.000 células/mm3 de sangre, lo que representa una diferencia altamente significativa de un mes a otro. Estos cambios son debidos a la existencia de una variación fisiológica circanual en los perros y no a una enfermedad (Sothern et al., 1993).
Parámetros tológicos como por elo, albúmina y globulina, también siguen un ritmo circanual (Figura 10). Se puede comprobar que las concentraciones máximas de estos parámetros se producen en distintos periodos del año: los picos de albúmina se observan durante el invierno y la primavera, mientras que los de globulinas se producen durante el verano y el otoño (Sothern et al., 1993).
La ritmicidad debería ser tenida en cuenta no sólo cuando se realicen investigaciones fisiológicas, sino asimismo en el caso de investigación farmacológica y toxicológica. Como se ha mencionado anteriormente (véase la lista de procesos biológicos que siguen un ritmo circadiano), la susceptibilidad a la infección y a la administración de fármacos siguen un patrón circadiano.
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Figura 11. Ritmo de susceptibilidad a la endotoxina de E. Coli. |
Por elo, la susceptibilidad de los ratones Balb/C a la endotoxina del E. coli, varía a lo largo de un periodo de 24 horas (Figura 11). Una dosis de endotoxina (100 µg/20 g, IP) compatible con la supervivencia de la mayoría de los animales cuando se administra en la mitad del periodo de oscuridad, es sinargo altamente letal cuando se administra entre 8 y 12 horas antes o después. Aaacute;s, se ha comprobado que el ritmo que presenta la susceptibilidad a esta endotoxina es reproducible en experimentos separados (Halberg et al., 1960).
Se ha demostrado que la susceptibilidad a la inyección de etanol presenta un ritmo: machos de la estirpe de ratón Balb/C fueron inyectados con una solución de etanol al 25%; en cada experimento, una serie de subgrupos diferentes fueron inyectados a intervalos de 4 horas, a lo largo de un periodo de 24 horas, comprobándose que la susceptibilidad a la inyección de etanol, sigue un ritmo de 24 horas demostrada por el número de muertes. Más del 50% de los ratones inyectados en una fase del ritmo, murieron como consecuencia de una sola dosis de etanol, que sólo causó la muerte al 30% de los ratones inyectados en otra fase del ritmo (12 horas antes o después; Haus y Halberg, 1959).
El conocimiento de los ritmos biológicos y su consideración a la hora de diseñar un experimento puede ayudar a reducir la variabilidad de las medidas cuantitativas que se realicen en los animales de laboratorio.
Asimismo, se pueden evitar falsas conclusiones cuando se determinen altas concentraciones del parámetro estudiado que son debidas a la variación fisiológica y no a la enfermedad.
También es posible optimizar los tratamientos de las enfermedades, si éstos son administrados en el momento correcto.
Conclusiones
Los animales son organismos procesadores de la información, que tratan de adaptarse continuamente a las condiciones experimentales mediante la utilización de mecanismos fisiológicos y comportamentales. Estos mecanismos homeostásicos de regulación están determinados no sólo genotípicamente, sino también fenotípicamente. Por ello, los animales no pueden ser utilizados como productos químicos en el desarrollo de protocolos experimentales, puesto que sus propias respuestas fisiológicas pueden alterar los resultados esperados de los estudios in vivo.
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