07 Mar Alteraciones de los componentes de la leche por tratamientos térmicos
Alteracionesde los componentes de
laleche por tratamientos térmicos
Dr. D. SalvioJiménez Pérez
25 de octubre de 1995
Excmo. Sr. Presidente
Excmos e Ilmos. Sres. Académicos
Señoras y señores
Quieroque mis primeras palabras sean de reconocimiento, admiración y gratitud, a laReal Academia de Ciencias Veterinarias y a los Ilustres Académicos que con subenevolencia y consideración me han proporcionado la inmensa satisfacción yhonor, de acogerme hoy en su seno como miembro numerario de la misma.
Quieroagradecer al Excmo. e Ilmo. Sr. Presidente, Profesor Dr. D. Mariano IlleraMartín, de cuya persona y cargo, vengo a recibir estos honores, y expresarle mideseo de colaboración tanto institucional como personal.
Gratitudespecial para los promotores e impulsores de mi ingreso. A mi Profesor y AmigoDr. D. Rafael Jurado Couto, que me honra al aceptar el compromiso de contestaral Discurso de Ingreso y a mi Compañero y Amigo Dr. D. José Alberto RodríguezZazo al que después de muchos años de andar por caminos profesionales distintosnos hemos vuelto a encontrar en esta casa.
Agradecimientoa quienes avalaron mi solicitud. Al Profesor Dr. D. Emilio Ballesteros Moreno,que tuve la suerte de conocer en la Cátedra del Profesor D. Félix Sánz Sánchezy la fortuna de ser su amigo. Al Profesor de Investigación Dr. D. Carlos BarrosSantos, antiguo compañero del Consejo Superior de Investigaciones Científicascuyo paso por el Instituto de Normalización, dejo una profunda huella en todosnosotros.
Elagradecimiento sincero a los Excelentísimos Académicos D. Vicente Serrano Toméy D. Amalio de Juana Sardón, que con su aprecio y consideración han dado animopara mi presentación a la Real Academia de Ciencias Veterinarias en la quelleno de ilusiones quiero contribuir de forma eficaz como veterinario a losprincipales fines de la misma como son fomentar y desarrollar las CienciasVeterinarias.
Noquiero dejar pasar esta ocasión de recordar a mi Profesor y Maestro, ProfesorD. Félix Sánz Sánchez, Miembro Fundador de esta Academia, del que tuve lasuerte de ser admitido en su Cátedra como alumno interno. Siguiendo su consejoy apoyo conseguí una beca de estudiante en el CENTRO EXPERIMENTAL DEL FRÍO delConsejo Superior de Investigaciones Científicas (C.S.I.C.), y hoy Instituto delFrio y por último el honor de tenerlo de director de tesis, cuya sabiduría ysencillez siempre dejaron un imborrable recuerdo en todos los que le conocimos.
Permítasemeun corto, pero no por ello menos afectuoso recuerdo hacia la persona que, desdela fundación de esta Docta Corporación, ocupó el Sillón número 1, que ahora meha sido asignado. El Profesor D. Carlos Luis de Cuenca y González-Ocampo, delas muchas promociones de alumnos que pasaron por su catedra, de las primeras pasomi padre y yo de las últimas. Una importante historia de la Veterinaria ha sidoescrita de su puño y letra o mejor, ha salido de su maquina de escribir, comoreza su libro jubilar, 50 años de actividad profesional en primera linea, de laque yo quisiera destacar su inquietud por la investigación, y cuando no eraposible por nuestros escasos medios, traia los investigadores relevantes aEspaña, en sus Congresos, para no alejarnos demasiado de la ciencia devanguardia y como muestra de su categoria internacional, basta un botón, decirque ademas de Presidente de esta Academia era miembro de 12 academiasrepartidas por todo el mundo, no pudiendo pensar, ni por lo más remoto, que amí me cabría el honor de sucederle, en el Sillón de la Real Academia de CienciasVeterinarias.
Anivel mas cercano y personal, una cariñosa mención para mi familia que me hanacompañado y ayudado en los momentos difíciles.
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TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN LECHE
Laleche, para ser consumida con garantías higiénico-sanitarias, necesita de untratamiento térmico previo. La acción del calor desencadena toda una serie demodificaciones físico-químicas que van a afectar a la calidad nutricional de laleche procesada. Estas modificaciones están relacionadas con la tecnologíaempleada y con las combinaciones temperatura/tiempo alcanzadas.
Existenmuchos compuestos químicos cuya formación o destrucción están íntimamenterelacionados con los procesos térmicos que se aplican a la leche. Lasmodificaciones que experimentan algunos de estos compuestos pueden llegar a serun índice valido para conocer el deterioro sufrido en la leche.
Losgrupos de investigación, defienden un parámetro de calentamiento al que son masafines, pero hoy en día, podríamos aventurarnos a decir que son pocos loscompuestos químicos que cumplan las premisas de sensibilidad, paracualquier rango térmico, y de estabilidad durante la vida comercial dela leche.
Pareceser, que la tendencia actual de la comunidad científica es la de aplicar conjuntamentevarios parámetros de calentamiento y de esta forma suplir sus carenciasindividuales para poder llegar a catalogar con precisión las modificaciones queexperimenta la leche con el calor.
Unode los índices de calentamiento mas extendidos desde su aparición en 1959, fuela determinación colorimétrica de 5-hidroximetil-furfural (HMF).
Enla bibliografía se recoge multitud de trabajos referentes a la formación deeste compuesto químico en la leche calentada. Sin embargo, algunos de estosestudios llegan a conclusiones opuestas y valores dispares. Esto es debido,principalmente, a la metodología de análisis aplicada y no al compuesto químicoen sí.
Poreste motivo, desde hace unos años se ha cuestionado seguir empleando el HMFcomo índice de calentamiento.
Paraavanzar en esta polémica se requiere poder determinarlo de una forma directa,sin necesidad de formar un complejo coloreado con el ácido 2-tiobarbitúrico.
Desarrollo y mejora de diferentes métodosanalíticos.
Nuestrogrupo de trabajo ha desarrollado una metodología alternativa a la colorimétricaque sirve para una cuantificación directa y precisa de HMF en leche y sistemasmodelo para cualquier rango de temperaturas.
Tambiénhemos diseñado, construido y patentado una planta piloto tubular decalentamiento indirecto de leche a nivel de laboratorio.
Otraetapa importante la constituye por una parte el estudio del comportamientotérmico del HMF y otros compuestos en diferentes sistemas de calentamientodirectos e indirectos, así como el estudio de las modificaciones queexperimenta la leche UHT durante los procesos de conservación hasta el límitede su vida comercial.
(Por último, se realizó un muestreo en lechecomercial española para conocer los niveles medios de los diferentes parámetrosde calentamiento estudiados.)
MÉTODO DE HMF POR HPLC.
Enla bibliografía, se recogen muchos trabajos relacionados con la separacióncromatográfica de furfurales en diferentes alimentos. Por ejemplo, lacuantificación de estos compuestos en zumos de frutas y mieles es empleado comoíndice de calidad. Sin embargo, en leche solamente se tiene constancia de unmétodo de análisis por cromatografía líquida en fase inversa.
Ladeterminación de furfurales en leche no es tan sencilla como en otros alimentosdebido a que se generan gran cantidad de compuestos químicos que puedeninterferir en la separación.
Inicialmente,se ensayó la metodología propuesta por Boekel y Rehman pero nos encontramos, enalgunas de las muestras, con contaminaciones en el pico correspondiente al HMFpor dos picos adyacentes denominados por nosotros X e Y. Esta contaminación sehacia mas evidente tanto en leches que habían sufrido un calentamiento masdrástico como en leches que llevaban varias semanas en almacenamiento a temperaturaambiente.
Estoscompuestos desconocidos interferían en la correcta cuantificación del HMF, porlo que optamos por modificar el método cromatográfico inicial.
Se estudiaron como afectaban las siguientesvariables en la separación:
-concentración salina de la fase móvil.
-el pH de la fase.
-y el porcentaje de modificador orgánico empleado.
Lasvariaciones en los tiempos de retención del HMF, expresados como el logaritmodel factor de capacidad frente a la concentración salina empleada en la fase paradiferentes valores de pH comprendidos entre 3,0 a 4,5. Se puede observar, comoa los valores de pH extremos no es viable la separación de HMF porque o bien,quedaba muy retenido en la columna, a altos valores de pH, o bien eluia casicon el frente, cuando el pH era mas ácido.
Cuandose representa gráficamente el numero de platos teóricos alcanzados por elsistema para HMF frente a la concentración salina de la fase se obtiene unmáximo de eficacia a 0,08M.
Operandode igual manera, parece ser que el pH óptimo para la separación de HMF es el de3,6. Los progresivos aumentos del pH repercuten en una pérdida de la eficaciaen el sistema.
Demanera secundaria a lo inicialmente previsto, nos dimos cuenta que en ladeterminación cromatográfica de HMF también pueden separarse simultáneamenteotros compuestos como el furfural y ácido levulínico, además de los doscompuestos desconocidos X e Y. Estos compuestos podrían temer un comportamientotérmicos característico.
Nospropusimos comprobar si las condiciones anteriormente fijadas para la fasemóvil eran también validas para separar estos compuestos. Ya que, el principalfactor limitante eran los elevados tiempos de retención del furfural.
Sedebe encontrar el equilibrio entre una eficiente separación de los compuestosacompañantes al HMF, para cualquiera que sea su concentración, y unos tiemposmínimos de retención de furfural.
Secomprobó, que las condiciones anteriormente descritas son también validas paraseparar el furfural. A la concentración salina de 0,08 M fue donde sealcanzaron los mayores valores de numero de platos.
Lamisma concentración salina se obtuvo para el compuesto X.
Deforma paralela, se estudió el efecto de la presencia de metanol en la fasemóvil sobre la retención del compuesto X, HMF, compuesto Y y furfural.
Lavariación en el logaritmo del factor de capacidad para cada uno de loscompuestos estudiados frente al porcentaje de metanol empleado en la fasemóvil. Los porcentajes de metanol estudiados estaban entre el 0 y 10%, siendoel máximo empleado por otros autores en otros alimentos.
Cuandolos porcentajes de metanol en la mezcla eran superiores al 3% no se llegó aalcanzar en el sistema la resolución necesaria para separar eficientemente elcompuesto Y del HMF.
Sinembargo, empleando un 3% podemos separarlos para niveles normales de HMF enleche tratada térmicamente.
Pero,si las muestras han sido sometidas a tratamientos térmicos mas drásticos elcompuesto Y se engloba en el pico del HMF. En este último caso no se llega aobtener una resolución completa a línea base.
Poreste motivo se decidió no utilizar metanol como constituyente de la fase móvil.
Delestudio desarrollado se determinó que la composición óptima de la fase móvil esla siguiente:
-Una solución salina de acetato sódico de concentración 0,08M ajustada con ácidoacético a pH 3,6.
Enestas condiciones el orden de elución de los compuestos es el siguiente:
-Levulínico, Compuesto X, HMF, Compuesto Y y Furfural.
PLANTA PILOTO DE LABORATORIO.
Siemprese ha trabajado con instalaciones industriales y semi-industriales, por lo quenos ha parecido importante construir una planta piloto de calentamientoindirecto a nivel de laboratorio.
Enesta planta experimental, la leche es calentada de manera continua a través deun sistema tubular construido en acero inoxidable y contenido en dos hornoseléctricos de temperaturas regulables.
faseA
,Inicialmente, la leche termostatizada, entre 30-33
°
C, atraviesa en el sistemaimpulsada por una bomba a un caudal constante de 187 mL/min.
faseB
.Posteriormente, la leche es calentada en dos intercambiadores de calor depotencia variable. El primer intercambiador puede alcanzar una temperaturamáxima de 250
°
C y por ello es empleado parapre-calentar la leche entre 42 y 72
°
C. La función del segundointercambiador es la de elevar la temperatura de la leche hasta la temperaturade análisis. El control de los hornos está regido por sendas unidades potencia.
Enla siguiente etapa, la leche es mantenida a la temperatura máxima de trabajodurante un tiempo determinado, es la etapa de mantenimiento de temperatura.
Ala salida la leche se encuentra a elevadas temperaturas por lo que resultanecesario un sistema de enfriamiento rápido antes de recoger la muestra. Por ello,se han conectado en serie dos circuitos de refrigeración.
Además,la instalación dispone de seis sensores de temperatura del tipo PT-100encapsulados en acero inoxidable que están conectados a un registrador central.Su misión, es el control de la temperatura en los puntos críticos de lainstalación como son:
-la temperatura inicial de la muestra (T1)
-a la salida del precalentamiento (T2) y del calentamiento (T3)
-a la salida del mantenimiento de temperatura (T4)
-y en las sucesivas fases de enfriamiento (T5) y (T6).
Acontinuación se pasa a exponer con algo mas de detalle los componentesprincipales de la instalación.
Launidad de medida y potencia está compuesta por un TRIAC regulado por un potenciómetro.
Lafunción del potenciómetro es muy importante ya que controla la deriva térmicaen el intercambiador de calor una vez alcanzada la temperatura deseada,estabilizandola en poco tiempo.
Otrocomponente es el denominado regulador de temperatura, A.
Aquíse fija la temperatura de trjo deseada, en L, y se rec lainformación se el calentamiento a través de un termopar, B.
Eltercer componente es el contactor que está conectado en serie con elregulador de temperatura y la unidad de potencia. Su misión es relacionar amboscomponentes.
De esta forma, cuando la temperatura elegidaes inferior a la determinada por el sensor permite al TRIAC que se envíepotencia a las resistencias en el intercambiador. También puede actuar demanera contraria, evitando un sobrecalentamiento.
El intercambiador de calor, estácompuesto de una resistencia eléctrica tipo Nicron (D), la cual estáenrollada uniformemente, dejando 1 mm de separación, se un t cerámico dealta capacidad térmica, (E).
Laresistencia eléctrica se conecta por sus terminales, (F), a la unidad demedida y potencia y se fija al t por un cemento cerámico dejo contenidoen hierro (C).
Lasiguiente capa es una lana de fa cerámica (B) que tiene como misiónaislar y prevenir la perdida de calor.
Porúltimo, todo el sistema esta protegido de exterior por una chapa de aceroinoxide (A) de 1 mm de espesor.
Por otra parte, el sistema dispone deun juego de 5 piezas intercambiables de mantenimiento de temperaturaconvenientemente aisladas. Cada tubo se diferencia en la longitud, donde a uncaudal constante de 187 mL/min, se pueden alcanzar diferentes tiempos decalentamiento.
Además,el diseño es tal, que permite acoplar varios tubos en serie dando tiemposmantenimiento de temperatura acumulativos.
Lasprincipales ventajas que ofrece esta planta son:
-La posibilidad de trabajar con pequeños volúmenes de leche (200 mL)
-La capacidad de alternar diferentes tiempo de residencia.
-Alcanzar la temperatura de trabajo en un corto espacio de tiempo.
-Ser empleada para otros productos líquidos y semi-líquidos.
TRATAMIENTOS TÉRMICOS.
Enuna siguiente etapa, se abordó el estudio de los efectos de los tratamientostérmicos sobre la formación de diferentes índices de calentamiento,principalmente sobre el HMF. En este sentido se dividieron los procesosempleados en directos e indirectos.
Como tratamiento directo se utilizó una plantapiloto APV de procesamiento UHT semi-industrial y como tratamientos indirectostanto la planta piloto de laboratorio como calentamientos en baño de glicerinade pequeños volúmenes de leche y sistemas salinos (SMUF).
Losestudios realizados en la planta piloto UHT-directa sirvieron de base paraconocer el comportamiento térmico del HMF, tanto para la metodologíacolorimétrica como para la cromatográfica.
Sellevaron a cabo ensayos a las temperaturas fijadas de 135
°
C, 142
°
C y 150
°
C y tiempos de residencia entre 2,5 y 20segundos. Se escogieron estas condiciones de trabajo porque eran similares alas empleadas en las industrias.
Unresumen de los valores medios de HMF detectados para cada combinación detemperatura y tiempo. En color amarillo se representa el HMF determinado por lametodología colorimétrica tradicional y en color rojo al HMF obtenido por latécnica cromatográfica desarrollada en esta memoria.
Podemosobservar como la formación de HMF aumenta proporcionalmente con la temperaturay tiempo de calentamiento, independientemente de la metodología aplicada.
Porotra parte, con el análisis colorimétrico detecta una formación superior de HMFy las diferencias entre ambos métodos analíticos aumentan a mayorestemperaturas.
Probablemente, esto es debido a la presenciade compuestos carbonílicos muy reactivos que forman complejos coloreados con elácido tiobarbitúrico en la misma región del visible.
Paraestudiar el comportamiento térmico del HMF durante un proceso UHT se ajustaronlos resultados obtenidos a una cinética de formación de orden cero.
La ecuación general correspondiente a unacinética de orden cero para un proceso de formación a una determinadatemperatura.
SiendoCt la concentración de HMF a un tiempo t y Co la concentración inicial de unode los reactantes, lactosa o lisina.
Losniveles de HMF habituales en leche, en comparación con el de los reactantes,permiten tomar al valor Co como constante durante el proceso e incluirlo en laconstante de reacción que ahora tendría otro significado.
Unavez realizados los cálculos cinéticos se llegaron a los siguientes resultados.
Se determinó un orden de reacción cero para laformación del HMF durante el proceso UHT para ambas metodologías.
Lasenergías de activación fueron de 124,19 KJ/mol para colorimetría y de 117,5KJ/mol para cromatografía.
Tambiénse calcularon matemáticamente los valores promedio del factor de Arrhenius, asícomo el coeficiente de temperatura y el valor Z.
Conociendo los valores de lasenergías de activación y del factor de Arrhenius se puede calcular la formaciónteórica de HMF para cualquier tiempo de residencia en el rango de temperaturasanalizado. Esto se lleva a cabo sustituyendo en la ecuación de Arrhenius laconstante de velocidad de reacción.
Finalmente,se analizó el contenido de HMF presente en 54 muestras de leche entera sinprocesar.
Parael método colorimétrico se han obtenido unos niveles medios de 4,59 μmol/Ly de 1,301 μmol/L para el cromatográfico. Estos valores serán utilizadoscomo blanco para sucesivos cálculos de HMF en muestras de leche tratadas dondeno se tenga constancia de la leche cruda de partida.
Sepuede asu, que el valor obteo de HMF por la téca cromatográa es elgenerado de “novo” a partir de los precursores de la reaccióntras el proceso de hidrólisis ácida, ya que la determinación cromatográfica deHMF es directa y no requiere de intermediarios coloreados.
Siguiendoesta premisa, el 71,6% de la concentración de HMF detectada por colorimetríasería debida a interferencias de otros compuestos en la reacción con el TBA.
Losvalores de leche cruda obtenidos por ambas metodologías y se muestra laecuación de regresión obtenida, con un factor de correlación de 0,86.
PLANTA PILOTO DE LABORATORIO.
Enla planta piloto de laboratorio se realizaron diferentes calentamientos en elrango de 96
°
C a 122
°
C, para tiempos de residencia de 1,2 a 16,2segundos.
Unprocesado standard tiene una duración de 130,5 s donde la leche parteinicialmente a 30-33
°
C y finalmente es recogida a 20
°
C.
Secalculó el factor de esterilización (F) de cada ensayo, sumando los factores deesterilización parciales en los 7 tramos.
Sedefine factor de esterilización o valor F o tiempo de calentamientoequivalente, como el tiempo requerido a una temperatura teórica de referenciapara ejercer el mismo daño térmico a la leche que en un proceso real.
Enlos cálculos del valor F se han tenido en cuenta la perdida de temperatura enla etapa de mantenimiento. Estas perdidas son normales en las plantas deprocesado indirecto y puede llegar a representar modificaciones importantes enel cálculo del valor F final, si no son tenidas en cuenta.
Losvalores de F alcanzados en los tratamientos realizados en esta planta varíanentre 1,09 s y 9,96 s, dependiendo siempre de la temperatura máxima alcanzada yel tiempo de residencia.
Sobreel conjunto de muestras procesadas se estudiaron los niveles de HMF ylactulosa, así como se aplicó por primera vez el método del agenteclarificante.
Seencontraron correlaciones significativas entre los valores de esterilizacióncalculados y los niveles de los índices de calentamiento ensayados.
TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN BAÑO DE GLICERINA.
Enuna siguiente etapa se estudió el comportamiento cinético de diferentescompuestos durante calentamientos indirectos en baño de glicerina.
Paraeste estudio se empleó tanto leche cruda entera como los diferentes simuladossalinos de ultrafiltración descritos en la diapositiva. Los sistemas SMUFestaban compuestos de lactosa, caseína y proteínas de suero en proporcionessimilares a la leche.
Los calentamientos se realizaron a lastemperaturas de 90, 120, 130 y 140
°
C y a los tiempos entre 150 y1500 s, dependiendo siempre de la estabilidad de la muestra.
Elestudio del comportamiento cinético de cualquiera de los compuestos cuyagénesis o degradación depende de los tratamientos térmicos sufridos por laleche es muy complejo debido a la existencia simultanea de reaccionesentrecruzadas.
Unade las principales reacciones que van a intervenir son las que involucran alcarbohidrato mayoritario de la leche, como son la reacción de degradación eisomerización así como las reacciones de Maillard cuando existe presencia derestos amino en el medio.
Porotra parte, también debemos prestar atención a las interaccionesproteína-proteína. Todas estas reacciones pueden tener lugar de forma aislada osimultanea, complicando aún mas el estudio.
Inicialmente,se estudió la formación de HMF en el sistema SMUF de lactosa tanto porcolorimetría como por cromatografía.
Laformación de HMF en este sistema es proporcional a la temperatura y tiempo decalentamiento, y este comportamiento también lo experimenta en los demássistemas modelo, independientemente de la metodología de análisis empleada.
ElHMF detectado en este sistema SMUF proviene únicamente de las reacciones deisomerización y degradación de la lactosa.
Enel sistema SMUF de caseína, la formación de HMF, tanto por colorimetría comopor cromatografía, es similar a la detectada en el sistema SMUF de lactosa.
Deigual manera se comporta durante los calentamientos de leche cruda.
Enlos sistemas que contienen proteínas, el HMF puede ser formado además por otravía, las reacciones amino-carbonilo, entre la lactosa y los restos lisil de lasproteínas. El HMF es solamente un intermediario de reacción y si lascondiciones en el medio lo permiten, puede seguir reaccionando hacia laformación de melanoidinas. Esta afirmación se ve apoyada por la aparición decoloraciones pardas en los sistemas estudiados a mayores temperaturas y tiemposde calentamiento.
Ala vista de los resultados parece ser que el HMF se genera, principalmentedesde las reacciones de isomerización y degradación de la lactosa y de manerasecundaria a través de la reacción de Maillard, aunque esta última reacciónparece que cobra importancia a las temperaturas mas elevadas.
Elcromatograma muestra la separación del HMF en el sistema SMUF de caseína. Eneste sistema es donde se alcanzaron los mayores niveles de formación para elcompuesto X.
Sitomamos al HMF como marcador del tratamiento térmico aplicado, se puedeobservar como la relación entre compuesto-X / HMF va disminuyendo en loscromatogramas de leche, proteínas de suero, y lactosa.
Laformación de compuesto X en este sistema SMUF es minoritaria y el picocromatográfico no llega a definirse de forma clara.
Eneste sistema tiene un comportamiento diferente al del resto, ya que es donde sealcanzaron las mayores concentraciones de HMF para cada una de lastemperaturas.
Estehecho podría ser explicado basándonos en la débil estabilidad térmica quepresentan las proteínas de suero.
Lacompleja estructura espacial de estas proteínas es uno de los factores quelimita su estabilidad al calor. Durante los calentamientos se ha ido perdiendoprogresivamente la estructura globular, de esta forma, quedan ahora expuestosal medio una serie de restos amino que antes permanecían protegidos deinteraccionar con la lactosa.
Eneste sentido se ve incrementada la Reacción de Maillard desde las temperaturasde desnaturalización, debido simplemente a un aumento en uno de los reactantes,la lisina.
Laleche, contiene proteínas de suero en la misma proporción que el sistema deWPC, sin embargo, no llega a alcanzar estos niveles de HMF. Este hecho puedeser explicado con las interacciones existentes entre las caseínas y lasproteínas de suero que tienen lugar en la leche calentada. Gracias a ellas, losrestos lisil quedan protegidos de la reacción con la lactosa por un simpleimpedimento estérico.
Porotra parte, las diferencias entre los métodos colorimétrico y cromatográficoaumentan con la temperatura y tiempo de calentamiento.
Comohemos señalado anteriormente, el ácido tiobarbitúrico no es un reactivoespecífico de HMF y puede reaccionar con otros grupos aldehídos generadosdurante el calentamiento de los diferentes sistemas, interfiriendo de estamanera en una correcta cuantificación de HMF por colorimetría. Por el contrariola determinación cromatográfica es directa y está libre de este tipo deerrores.
Estehecho se ve reflejado de una manera muy clara en la determinacióncromatográfica de HMF en el sistema de proteínas de suero. En este sistema nose llegan a alcanzar las concentraciones de HMF detectadas por colorimetría.
Tantopara la leche como los sistemas SMUF estudiados, la formación de HMF,determinado tanto por colorimetría como por cromatografía, se ajusta a unacinética de reacción de orden cero.
Losvalores de energías de activación obtenidos para leche son similares a los deotros autores.
Porcromatografía se obtuvieron unas energías de activación de 118,57 KJ/mol enleche, 93,04 KJ/mol en el sistema SMUF de proteínas de suero, 103,5 KJ/mol enel sistema SMUF de caseínas y de 118,5 KJ/mol en el sistema SMUF de lactosa.
Nose tiene conocimiento de datos cinéticos anteriores en la bibliografíarelativos a la determinación cromatográfica de HMF.
Tambiénse ha estudiado la cinética de formación de ácido levulínico, en leche y en lossistemas SMUF de caseína y proteínas de suero, ya que, en contra de loinicialmente esperado, no se detectó en el sistema SMUF de lactosa.
Poreste método las concentraciones de levulínico, expresadas en milimoles/L,aumentan proporcionalmente con la temperatura y tiempo de calentamiento enleche.
Lacinética de formación de ácido levulínico se ajusta a un orden cero tanto enleche como en los sistemas SMUF de caseína y proteínas de suero.
Seobtuvieron unas energías de activación de 75,36 KJ/mol para leche, 91,03 KJ/molpara el sistema SMUF de proteínas de suero y de 69,77 KJ/mol para el sistemaSMUF de caseína.
Laestimación del porcentaje de lisina no disponible es una buena herramienta paraconocer la extensión de las etapas iniciales de la reacción de Maillard.
Eneste trabajo se ha estudiado la degradación de lisina utilizando dos métodosfluorimétricos de gran sencillez si los comparamos con los métodoscromatográficos donde las etapas de hidrólisis retrasaban demasiado losanálisis. Los métodos descritos en esta memoria están concebidos para serempleados rutinariamente y emplean tanto fluorescamina como reactivo OPA comoagentes fluorófobos.
Losresultados obtenidos son totalmente comparables por ambos métodos. Los mayoresporcentajes de bloqueo de lisina se determinaron en el sistema SMUF deproteínas de suero, estando en relación estos resultados con los mayoresniveles de HMF detectados en ese sistema.
Enla leche fue donde se registraron las perdidas menores de lisina tanto para elreactivo OPA como para fluorescamina. Esto es debido a las interaccionesproteína-proteína que impiden estericamente la formación de lactulosil-lisina.
Parael estudio cinético se emplearon las ecuaciones abajo descritas.
Lacinética de destrucción de lisina en leche y sistemas SMUF se ajusta a unsegundo orden.
Lasenergías de activación obtenidas, empleando como reactivo la fluorescamina,fueron de 69,77 KJ/mol para leche, 105,13 KJ/mol para el sistema SMUF deproteínas de suero y de 94,55 KJ/mol para el sistema SMUF de caseína.
Utilizandoel reactivo OPA como marcador de restos lisil se obtuvieron energías deactivación similares.
Parala determinación de lactulosa se ha utilizado una modificación al métodoespectrofotométrico descrito por Adhikari.
Elprincipio del método está basado en el hecho de que las cetosas sondescompuestas más fácilmente que las aldosas por la acción de ácidos minerales.
Comola leche calentada no contiene más cetosas que la lactulosa en cantidadessignificativas, el principio aplicado en este método es específico para ladeterminación de lactulosa.
Enla diapositiva se representa como es pequeña la interferencia de una solucióndel 5% de lactosa en el método.
Sinembargo, este método no puede ser aplicado sobre cualquier sustrato ya quepresenta algunas limitaciones, en este sentido estamos en desacuerdo con elautor.
Empleandoesta metodología fue imposible determinar, con un margen de error aceptable, laformación de lactulosa en los sistemas SMUF de lactosa, caseína y WPC.
Encambio, si se pudo determinar en leche. En la gráfica se representa laformación de lactulosa para las condiciones estudiadas.
Lacinética de formación de lactulosa en leche se ajusta a un orden uno con unaenergía de activación de 113,53 KJ/mol.
Desdehace algunos años ha aparecido un método rápido para diferenciar lechestratadas térmicamente. El método está basado en la medida de absorción a 340 nmde una solución de leche clarificada.
Enleche fue donde se obtuvieron los mayores valores de absorbancia para delíndice del agente clarificante. En los sistemas SMUF de caseína y WPC seobtienen valores similares.
Laevolución del índice del agente clarificante se ajusta a una cinética deformación de orden cero. Con energías de activación de 70,10 KJ/mol para leche,101,56 KJ/mol para proteínas de suero y de 101,29 KJ/mol para el sistema SMUFde caseína.
Tampocose tenía conocimiento de anteriores citas bibliográficas relativas a lacinética de ácido levulínico.
Ladeterminación de intermediarios fluorescentes nos da idea de la extensión delas etapas finales de la reacción de Maillard, la formación de polímerospardos.
Seregistraron niveles mínimos, pero detectables, de fluorescencia en el sistemaSMUF de lactosa. Esto parece una contradicción, pero la fluorescenciadesarrollada en sistemas en ausencia de grupos amino tiene una génesisdiferente y por ello unos máximos de absorción y emisión característicos.
Losniveles máximos de fluorescencia, medidos como % de fluorescencia relativa, seobtuvieron en leche.
Laacumulación de fluorescencia es proporcional a las condiciones de calentamientoempleadas.
Lacinética de formación de intermediarios fluorescentes en leche y sistemas SMUFde caseína y proteínas de suero se ajusta a un orden cero.
Sinembargo, el comportamiento cinético del desarrollo de fluorescencia en elsistema SMUF de lactosa se ajustaba mejor a un primer orden.
EFECTOS DE LA CONSERVACIÓN EN LECHES UHT.
Enuna siguiente etapa se estudiaron las variaciones en los niveles de HMF sobrecuatro muestras de leche UHT conservadas durante 90 días a las temperaturas de6, 20, 30, 40 y 50
°
C.
Serealizaron para este estudio, los diagramas de temperatura y tiempo para cadauna de las instalaciones industriales estudiadas. Las plantas I y IIcorresponden a un procesado UHT indirecto y las III y IV a uno directo.
Elperfil de calentamiento del proceso nos puede dar una idea aproximada de laseveridad del tratamiento térmico aplicado a la leche. Pero, integrando el áreade la curva obtenemos un valor con el que podremos comparar procesos térmicostotalmente diferentes.
Algunosautores se limitan a calcular el daño térmico del proceso solamente en el áreaque cubre la temperatura de esterilización.
Enlos tratamientos indirectos, donde las etapas de enfriamiento ypre-calentamiento son importantes, obviar este cálculo puede ser causa de unerror grave en el cálculo final del valor de F.
Losvalores mayores de F corresponden a las muestras I y II. Esto es debidofundamentalmente a la tecnología empleada. En los tratamientos directosalcanzar la temperatura de esterilización es un paso casi instantáneo y encambio en los sistemas con tratamiento indirecto este paso resulta masprogresivo.
Entodas las muestras se observó un comportamiento similar del HMF, determinadotanto por colorimetría como por cromatografía, durante la conservación.
Laformación de HMF depende de la temperatura de almacenamiento. Solamente seobservó una formación neta de HMF a las temperaturas superiores a 30
°
C. A la temperatura de 20
°
C parece ser que existe un equilibrio entrelos procesos de formación y destrucción de HMF.
También,la formación de HMF parece ser que depende del tiempo de almacenamiento porque,aproximadamente, a los 60 días y a las temperaturas de 30 y 40
°
C, se observó una perdida de linearidad entodas las muestras.
Porotra parte, parece ser que la formación neta de HMF durante el almacenamientopara las temperaturas de 30
°
C, 40
°
C y 50
°
C es mayor cuanto menor es el valor de F delproceso. Es decir, en las muestras con tratamiento UHT directo, existe unaformación neta superior de HMF que en las UHT indirectas.
Lacinética de formación de HMF durante la conservación de leche UHT hasta límitede vida comercial se ajusta a un orden cero, tanto para la determinacióncolorimétrica como para la cromatográfica.
Nose conocían con anterioridad datos bibliográficos relativos a cálculos deenergías de activación de HMF determinado por cromatografía para un proceso deconservación de leche UHT comercial.
ANÁLISIS DE LECHES COMERCIALES.
Conla finalidad de conocer la realidad comercial en nuestro país se han estudiadolos niveles de diferentes compuestos en muestras de leche comercial española.El estudio se ha centrado en leche UHT aunque también se han analizadopasteurizadas y estériles.
Elvalor medio de HMF para leche UHT fue de 5,160 μmol/L para cromatografía yde 8,07 para colorimetría.
El53% de las muestras UHT analizadas se encuentran comprendidas en el rango de3,6-6,0 para cromatografía, mientras que el 61% de colorimetría está en elrango de 6,0 a 9,6.
Entodas las muestras estudiadas se detectó la presencia del compuesto desconocidoX.
Elvalor medio encontrado fue de 8,869 unidades de área.
Lapresencia de ácido levulínico en leche es muy constante, donde todas lasmuestras se encuentran entre concentraciones de 1 a 3mM.
El 55,5% de las muestras UHT se incluye en elrango de 1,8 a 2,4 mM.
Deigual forma a lo que ocurre con el levulínico, no se conocen referenciasbibliográficas relativas al contenido en furfural de leche comercial.
Elvalor medio encontrado fue de 2,02 μmol/L y el 78% de las muestras tienenconcentraciones entre 1,5 y 3 μmol/L.
Lasconcentraciones relativas de cada uno de los compuestos experimentan un aumentoen la leche UHT. Respecto al compuesto Y no se detectó en el 5,5% de lasmuestras analizadas.
Seobtiene un valor medio de bloqueo del 2,4% para fluorescamina y del 2,3% paraOPA.
Estosporcentajes pueden aumentar en las muestras de leche estéril analizadas a un5,7% para fluorescamina y un 5,8% para OPA.
Tambiénse analizó la presencia de lactulosa por el método espectrofotométrico.
La concentración media de lactulosa encontradaen leche UHT española fue de 42,63 mg/100mL.
Segúnla Federación Internacional de Lechería el límite máximo admisible es de 60mg/100mL.
Eneste caso, el 17% de las muestras estarían sobreprocesadas, incluso, se detectóuna muestra con niveles superiores a 80 mg/100mL.
Tambiénse analizaron los niveles del índice del agente clarificante. El valor mediodetectado fue de 0,125 unidades de absorbancia.
LaFIL propone como valores medios para el tratamiento UHT unos niveles mínimos deß-lactoglobulina no desnaturalizada de 20 mg/100mL.
Estacondición no es cumplida por el 47,2% de las muestras, de las cuales el 47,0%tiene niveles inferiores a 6 mg/100mL.
Elcontenido medio de ß-lactoglobulina en leche UHT fue de 26,2 mg/100mL.
Losniveles de estas proteínas van a descender en leche UHT, desapareciendo la BSA.
Paraun proceso de esterilización clásica la totalidad de las proteínas de suero seencuentran desnaturalizadas.
Medianteanálisis de regresión lineal se determinó la relación entre todas las variablesestudiadas en las muestras de leche UHT.
Nose encontraron relaciones significativas entre el compuesto Y, acido levulínicoy furfural con ninguna de las otras variables. La formación de estos compuestosquímicos en leche UHT no es constante y dependen de otros factores, además deltratamiento térmico.
Porotra parte, hay que señalar que los niveles de levulínico y el valor de pHestaba relacionados entre si con un factor de correlación de 0,5, sin embargono se encontraron relaciones significativas entre el contenido de lactulosa yvalor de pH.
Losvalores de los índices de correlación mejoran significativamente si se incluyenen el estudio las muestras pasteurizadas y esterilizadas.
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en nuestros estudiosse han realizado a tres niveles : Industrial, en empresas españolas y alemanas;en planta piloto en una instalación de la firma APV de tratamiento directo eindirecto de leche del Instituto de Fermentaciones Industriales del CSIC enArganda del Rey y a nivel de laboratorio en una planta de tratamiento indirectode leche en continuo, diseñada en nuestro laboratorio y protegida con unapatente de invención.
Se ha descrito un método de cromatografíalíquida de alta eficacia de determinación de HMF más rápido que elcolorimétrico tradicional, que además de determinar furfural y acido levulínicose obtienen dos compuestos desconocidos que hemos denominado X e Y y seencuentran en fase de identificación.
La formación del este compuesto X se relacionacon ciertos niveles de HMF, índice del agente clarificante, ciertos niveles deintermediarios fluorescentes y contenidos en lactulosa y de forma inversa conel contenido en proteínas de suero desnaturalizadas, lisina biológicamentedisponible y el índice de proteólisis.
Se ha comprobado que el valor medio de HMF enleche cruda española es de 4,59 micromoles por litro en la determinacióncolorimétrica tradicional y de 1,30 micromoles por litro en el métodocromatográfico.
La leche UHT comercial tiene un valor medio defurfural de 2,02 micromoles por litro.
Se puede clasificar la leche por su contenidoen HMF determinado por cromatografía en:
lechepasteurizada = 1,110
lecheUHT = 5,160
yleche estéril = 9,546 micromoles porlitro.
Lacinética de formación de HMF total tiene una energía de activación de 124,2 kJmol. para la metodología colorimétrica y 117,5 kJ mol. para la cromatográfica,// para un tratamiento de 135º a 150ºC entre 2,5 y 20 segundos.
Seha determinado la cinética de formación del ácido levulínico en leche,ajustandose a una reación de orden cero y con una energía de activación de 75,3 kJ mol. en rangos de calentamientode 90º a 140ºC.
Parala lactulosa determinada por espectrofotometría se ha obtenido una energía deactivación de 113 kJ mol. para una cinética de primer orden.
Elporcentaje medio de destrucción de lisina biológicamente disponible es del5,75% del inicial.
Enleche UHT comercial, la presencia media de lactulosa es de 42,63 mg/100ml. y elcontenido en beta-lactoglobulina es de 26,2 mg/100ml.
Laformación de galactosa durante el tratamiento térmico en leche presenta dosfases con energías de activación diferentes.
una energía de activación entre 90º y 120ºCde 25,44 kJ/mol
y otra entre 120º y 150ºC de 100,17kJ/mol.
Ladeterminación de galactosa sirve como índice de calentamiento para todos losprocesos entre 80º y 150ºC de temperatura y tiempos entre 1 y 100 segundos,pudiendose clasificar también la leche en:
pasteurizada menos de 0,25 mg/100 mlde leche
UHT entre 0,25 y 5 mg /100ml.
y estéril mas de 50 mg/100 mal deleche.
Laformación de grupos sulfhidrilo (SH) tiene una cinética de orden 1,7 con unaenergía de activación de 151,171 kJ/mol. Los grupos sulfhidrilo libres soncapaces de proteger la oxidación de la vitamina C de la leche. Esta formaciónse encuentra estrechamente ligada a la desnaturalización por calor de proteínasdel suero.
Lasproteínas del suero se desnaturalizan por acción del calor siguiendo unacinética de 2º orden y le corresponden unas energías de activación de:
343,30 kJ/mol entre 70º y 95ºC
y de 33,31 entre 95º y 150ºC
Por último el proceso de desnaturalización deproteínas del suero de leche se desarrolla en dos fases diferenciadas, debidoal cambio de formación sufrido por la beta-lactoglobulina.
CONCLUSIÓN FINAL
Todoslos estudios sobre alteraciones de los componentes de la leche por tratamientostérmicos empezaron con un parámetro máximo de calentamiento como índice dedesaparición de Vitamina B6 y un mínimo de destrucción del Bacillusstearothermophillus. Actualmente se han ampliado estos parámetros a los antes mencionados en esta lectura, quehan servido para mejora de la calidad y eficacia de los tratamientos térmicosen leche y continuará con el estudio e identificación de compuestosdesconocidos de la reacción de Maillard y se completará con el tratamientoetiológico de enfermedades de origen hepático.
Hedicho
DISCURSODE CONTESTACIÓN DEL
EXCMO.SR. D. RAFAEL JURADO COUTO
Conocimosal Doctor Jiménez Pérez, hace alrededor de treinta años, cuando estudiando éllos últimos cursos de la Licenciaturade Veterinaria, en esta Facultad, se aproximó a la cátedra de Farmacología yToxicología para aprender algo de la mucha investigación que sabía Don Félix.Allí estuvo poco tiempo, ya que visto por mi maestro sus aptitudes ypreferencias, le apadrinó para que acudiera al Centro Experimental del Frío,para que se fuera formando al lado de algunos de sus antiguos discípulos D.Rafael Pozo Fernández, D Eugenio García Matamoros (antiguos académicos yafallecidos), D. Ángel Goicoechea y D. Antonio Moral Rama.
Lafinalidad de dicha decisión es que el centro citado era y es un magnificocrisol pluriprofesional de investigadores, puesto que en él conviven y trabajanbiólogos, veterinarios, ingenieros de diversas ramas, químicos, etc. y tanacertada fue que es donde el recipiendario ha desarrollado su laborinvestigadora y profesional desde 1969 hasta hoy excepto tres años que ha estado becado en el Instituto deTecnología Láctea de Kiel (Alemania).
Enel Instituto del Frío, que es como se denomina hoy, el Dr. Jiménez Pérez haocupado los puestos de Becario, Colaborador Científico e InvestigadorCientífico, todo ello dentro del Conse
