07 Mar Últimos avances en la patología del Lince ibérico (Lynx pardinus)
Últimos avances en la Patología del Lince ibérico (Lynx pardinus)
Laura Peña1, Belén Sánchez1, Pilar García1, Mª Ángeles Jiménez2, Mª Dolores Pérez-Alenza1, Alberto Benito2.
1 Profesoras y 2 Becarios del Dpto. de Medicina y Cirugía Animal. Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid.
El Lince ibérico Lynx pardinus) es uno de los felinos salvajes en mayor peligro de extinción del planeta; la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza ha incluido esta especie en su lista roja en la categoría “critically endangered,” lo que significa que está en el máximo riesgo de extinción1. Actualmente se localiza sólo en dos pequeñas áreas aisladas en el Sur de España: el área de Doñana y Sierra Morena, y se considera que la población total es menor de 200 individuos1,2. El descenso masivo que han sufrido las poblaciones de Lince ibérico en la Península se debió en los años 50-60 a la falta de su presa principal, el conejo, debido a la mixomatosis, pero, en la actualidad, la mayor parte de los linces que aparecen muertos han sido atropellados en alguna de las carreteras que cruzan sus hábitats (Fig.1).
Nuestro grupo de trabajo, perteneciente al Servicio de Anatomía Patológica de la Facultad de Veterinaria de Madrid, inició sus estudios sobre el Lince ibérico en
febrero de 1998 cuando desde el Parque Nacional de Doñana se nos remitieron muestras para su análisis histopatológico de aparato genital de una hembra de Lince ibérico,
“Elsa,” de 11 meses de edad, que había aparecido atropellada. No se pudo precisar ningún diagnóstico histopatológico concreto debido al avanzado estado de autolisis de las muestras. El deterioro de las muestras debido a la autolisis es uno de los problemas con el que nos hemos encontrado en ocasiones a lo largo de estos años. En mayo de 1998 nos enviaron muestras de diversos órganos de otra lince hembra, “Romana,” de 2-3 años y que también había muerto atropellada. En este caso, además de las lesiones características de shock traumático, detectamos una depleción linfoide en diversos tejidos. La cuestión que realizamos a la veterinaria del Parque fue: “…¿puede existir una
virosis sistémica inmunosupresora en este animal?…” pero las pruebas de diagnóstico para agentes inmunosupresores habían sido negativas. El año siguiente (mayo, 1999) recibimos muestras de piel de la cabeza de “Isabel,” una ra de 12-13 años que se encontraba cautiva para la curación de una herida por trampa en una extdad. “Isabel” presentaba, aaacute;s de la herida, áreas de alopecia en frente y orejas. Se nos pedía diagnóstico diferencial entre dermatitis alérgica, parasitaria o tumor. En la biopsia cutánea tida se diagnosticó un carcinoma incipiente de células escamosas in situ debido a la presencia de algunas células displásicas sin rotura de ranas basales (Fig.3). En novre de ese mismo año, nos enviaron nuevas muestras de la piel de la cabeza (Fig.4) y de la herida de la extdad, que seguía sin cicatrizar (Fig.5). En esta ocasión, el diagnóstico de la biopsia de la muestra de la cabeza fue de “carcinoma de células escamosas in situ avanzado, y el de la extremidad, carcinoma células escamosas (Figs. 6 y 7).
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Dado que éste es un tumor muy infiltrante se decidió la amputación de la extremidad. En mayo de 2000, Isabel muere con un deterioro progresivo de su estado y bronquitis crónica, encontrándose en el estudio histopatológico, tuberculosis pulmonar y algunas células metastásicas carcinomatosas en el pulmón, además de una marcada depleción linfoide generalizada. En este caso, pensamos que el estado de inmunodeficiencia podría haber facilitado el desarrollo tanto de la tuberculosis como del tumor cutáneo múltiple, aunque bien es cierto que también podría haberse dado el hecho inverso, es decir, ser ambos procesos patológicos los causantes del estado de inmunodeficiencia. Esta última posibilidad nos pareció menos probable, ya que, en general, sólo procesos tuberculosos y tumorales ampliamente diseminados son causa de inmunodeficiencia. Además de la “coincidencia” de la coexistencia de ambos procesos en el mismo animal. Insistimos pues, de nuevo, en la posibilidad de que existiera una infección por virus inmunosupresores de forma subclínica o no detectada por los métodos empleados de diagnóstico.
A partir de entonces,
en las nuevas muestras remitidas de Linces ibéricos, también se encontraba depleción linfoide, que viene definida histológicamente por hipocelularidad y menor desarrollo de folículos linfoides3.
Decidimos entonces realizar una revisión histológica sistemática de las muestras que estaban archivadas correspondientes a los tejidos linfoides de Linces ibéricos encontrados muertos o muertos en cautividad entre 1998-2003. Se trataba de un total de 17 animales (8 hembras, 9 machos), con edades variadas (10 meses-16 años), salvajes (n=14) y cautivos (n=3), y de las dos poblaciones (Doñana, n=15; Sierra Morena, n=2). Los animales contaban con estudios post-mortem que incluían (cuando era posible) análisis generales hematológicos, tests de diagnóstico para agentes infecciosos y parasitarios. Nuestro estudio concreto se centró en establecer con hematoxilina-eosina y con técnicas histoquímicas el “grado de depleción linfoide/animal”, que categorizamos en normal, ligero, moderado y severo, considerando otras posibles patologías.
La mayoría de los animales había muerto por atropello (n=9), 7 por enfermedad y 1 tras una pelea con otro macho. Como resumen de las patologías más relevantes encontradas indicaremos que tres Linces ibéricos presentaban tuberculosis pulmonar y/o generalizada y que en tres casos (uno coincidiendo con tuberculosis) existieron tumores epiteliales malignos: carcinomas de células escamosas (Fig. 10) y carcinoma de células transicionales. Interesa señalar que los tests de diagnóstico de agentes inmunosupresores habían resultado negativos en la mayoría de los animales.
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Un caso interesante es el de “Fermín,” un Lince ibérico macho que presentaba ceguera desde muy joven; en el estudio histopatológico de la necropsia se observó tuberculosis pulmonar diseminada a ganglios, glándulas adrenales y globo ocular (Fig. 11). En este último tejido, la lesión histológica encontrada era una uveítis granulomatosa tuberculosa con lo que establecimos que la causa de la ceguera era la tuberculosis ocular que padecía el animal.
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En definitiva, los animales presentaban una depleción linfoide generalizada coexistiendo con una alta prevalencia de tuberculosis (Mycobacterium bovis) y de tumores, resultando esta última, aproximadamente 67 veces mayor que la incidencia del gato doméstico4
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El grado de depleción linfoide/animal (DL) con H-E no se pudo establecer en 2 casos (autolisis), no existió en un animal, fue ligero en 7 animales, moderado en 5 y severo en 2. La intensidad de la DL fue independiente del origen, cautividad o causa de la muerte de los animales, aunque se observó que la DL aumentaba con la edad.
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Asimismo, llamó la atención otro hallazgo de interés en los tejidos linfoides: la presencia de depósitos hialinos en los centros germinales despoblados. La composición y el significado de estos depósitos están aún por determinar.
Para conocer qué poblaciones celulares inmunes concretas se encontraban disminuidas en los tejidos linfoides, procedimos a realizar el marcaje inmunohistoquímico de las mismas mediante diversos anticuerpos que nos permitieron el marcaje de las mismas en tejidos incluidos en parafina. Los anticuerpos empleados fueron: CD3 (marcador pan-células T), CD79 (marcador de células B maduras), MAC 387, antígeno Mieloide/Histiocito (marcador mayoritario de monocitos y macrófagos) y CD68 (marcador mayoritario de monocitos y macrófagos).
En la mayoría de los animales, la depleción linfoide observada con H-E coincidió con un descenso paralelo de células positivas a CD3 y CD79 lo que indica la presencia de una inmunodeficiencia combinada de ligera a moderada que afecta a las subpoblaciones T y B. Sin embargo,
los niveles de macrófagos y células dendríticas fueron normales o aumentaron lo que podría deberse a una compensación tisular tras la pérdida de las otras poblaciones celulares.
Para comprender el significado y la posible causa de estos hallazgos, debemos recordar que las causas generales de inmunodeficiencia primaria (congénita) son genéticas, mientras que las causas que dan lugar a inmunodeficiencia secundaria (adquirida) son variadas y entre ellas se encuentran:
la malnutrición, la edad avanzada, la existencia de enfermedad neoplásica diseminada, la aplicación de tratamientos con inmunesores (corticoides, quimioterapia, radioterapia) y la infección de células inmunocompetentes por agentes infecciosos (lentivirus FIV, FeLV) y otros. Nuestros hallazgos parecen indicar que estamos ante la presencia de una inmunodeficiencia primaria en los ejemplares de Lince ibérico estudiados, aunque no debemos descartar la posibilidad de que sea una inmunodeficiencia secundaria debida a la presencia de virus (u otros agentes) no detectados con las técnicas de diagnóstico utilizadas. El origen congénito y genético de las alteraciones inmunitarias del Lince ibérico también se vería justificada, ya que: a) la disminución linfoide se encontró incluso en animales jóvenes muertos por atropello; b) utilizando métodos de detección diversos, de hecho, son escasos los animales que son positivos a agentes inmunesores; c) existe consanguinidad en el Lince ibérico, debida al bajo número de individuos y el aislamiento de las dos subpoblaciones5; asimismo, se sabe que la consanguinidad en otros felinos salvajes en peligro de extinción ha derivado en alteraciones del sistema inmune como, por ejemplo los defectos en el MHCII por la pérdida de variabilidad genética en la pantera de Florida6.
Fig. 13. Lince ibérico. Riñón. Glomerulonefritis membranosa (izquierda, PAS). Esclerosis glomerular (derecha, Masson).
Nos gustaría indicar que lo que aquí hemos expuesto es un resumen de los resultados preliminares que hemos obtenido y que, por supuesto, son necesarios estudios en profundidad. Las alteraciones del sistema inmune podrían agravar, aún más, la supervivencia del lince ibérico que se podría ver desprotegido, en menor o mayor medida, frente a diversos agentes infecciosos, favoreciéndose la aparición de diversas enfermedades, así como originando una menor protección de las vacunas empleadas en los individuos en cautividad.
Una segunda parte de nuestro trabajo ha consistido en el estudio de las lesiones glomerulares de los Lince ibéricos en muestras de riñón recogidas entre los años 1998 y 2003. Nos llamó la atención desde la recepción de las primeras muestras la existencia de alteraciones en los glomérulos renales de la mayoría de los animales. Por eso, procedimos a revisar histológicamente y las muestras renales de que disponíamos empleando además técnicas específicas que profundizaran en el diagnóstico histopatológico. En total, revisamos de forma sistemática muestras de riñones (n=16) fijados en formol, incluidos en parafina y teñidos con H-E, tricrómico de Masson, PAS (reactivo de Schiff) y técnica de plata. El estudio histopatológico reveló que
todos los animales presentaban una glomerulonefritis membranosa (GN-M) en distinto grado: 5 GN-M ligera, 7 GN-M moderada y 1 GN-M severa (3 no evaluables por autolisis).
Recordemos que la
GN-M se debe al depósito tisular de inmunocomplejos formados por la unión de antígenos internos (autoanticuerpos) o externos (infecciosos, tumorales…), produciéndose en engrosamiento de las membranas basales (MB) de los capilares glomerulares. Hemos de indicar, sin embargo, que en los felinos, la mayoría de las GN-M se consideran idiopáticas7. En ocasiones, el estado final dela GN-M es la esclerosis glomerular en la que el glomérulo es sustituido por una sustancia rica en colágeno.
Una misma muestra podía presentar glomérulos en distinto grado de lesión como se ilustra en la figura 14.
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Nuestro estudio revela que existe una elevada prevalencia de glomerulonefritis membranosa (GN-M) en el Lince ibérico, ya que se observó GN-M focal y multifocal en todos los animales, coexistiendo con glomeruloesclerosis focal en algunos casos. La GN-M se agrava con la edad del animal. Por su importancia para nuestros resultados, es interesante indicar que en un estudio realizado en otro felino en peligro de extinción, el guepardo, se describió
glomeruloesclerosis idiopática en el 80% de los guepardos cautivos8.
En este punto de las investigaciones nos preguntamos:
¿cuál es la composición del material membranoso?,
¿existen inmunocomplejos?. Para contestar en cierta medida la primera pregunta nos propusimos
detectar con técnicas inmunohistoquímicas la expresión de laminina, colágeno IV y fibronectina en las membranas engrosadas; estas sustancias son componentes normales de las membranas basales. Para contestarnos a la segunda pregunta, decidimos verificar o descartar la existencia de la porción del inmunocomplejo (IC) correspondiente al anticuerpo, mediante la determinación inmunohistoquímica de IgM e IgG. Los resultados indican que los
depósitos membranosos glomerulares expresan intensamente laminina, colágeno IV y fibronectina y que esta expresión se incrementa en fases avanzadas.
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Además, en las GN-M existió inmunorreacción a IgM e IgG en línea a lo largo de las membranas basales, lo que indica la posible presencia de IC. Para confirmar estos resultados realizamos análisis con microscopía electrónica. El hallazgo ultraestructural más interesante fue la presencia de cantidades variables de depósitos intramembranosos electrodensos compatibles con inmunocomplejos.
Lógicamente, la siguiente cuestión es ¿qué antígenos forman los IC, antígenos internos o externos?. Por el momento no estamos en disposición de responderla; nuestros resultados indican una alta
prevalencia de GN por inmunocomplejos, aparentemente no relacionada con agentes infecciosos, por lo que
las lesiones glomerulares podrían ser debidas a alteraciones del sistema inmune y atribuidas a consanguinidad. De todas formas, no descartamos la existencia de algún agente patógeno no detectable con las técnicas disponibles en la actualidad.
Aún a pesar de lo inicial de estos estudios, su importancia radica en la vulnerabilidad que añade al Lince ibérico en cuanto a su correcta funcionalidad renal, ya que el engrosamiento de la MB glomerular altera la filtración de la orina primaria y ocasiona insuficiencia renal que se marca analíticamente por la proteinuria.
Revisando los urianálisis disponibles de Linces ibéricos de los últimos años, hemos encontrado que de 19 animales en los que existía analítica urinaria (10 incluidos en el presente estudio) 18 tenían proteinuria variable (de + a +++) y un animal carecía de ella. Dado que la muestra estudiada es muy representativa de la población de esta especie que existe en la actualidad (16/200), sería conveniente considerar una disfunción renal en el resto de los individuos, especialmente desde el punto de vista clínico, por ejemplo para el empleo seguro de anestésicos o antibióticos con posible efecto nefrotóxico.
Por supuesto, lo que aquí hemos expuesto son sólo pinceladas de un estudio mucho más amplio financiado por el Ministerio de Medio Ambiente que en la actualidad está progresando gracias a la colaboración de muchos profesionales que trabajan en diversos ámbitos relacionados con el lince ibérico. A todos ellos, muchas gracias.
Agradecimientos: a Celia Sánchez, Pilar Fernández y Margarita Galka. Veterinarias del Parque Nacional de Doñana durante la realización del estudio.
Estudio financiado por el Ministerio de Medio Ambiente. Proyecto Parques Nacionales 90/2002.
Bibliografía:
1. IUCN: Red List of Threatened Species. http://www.redlist.org.
2. Guzmán, N.: Censo-diagnóstico de las poblaciones de lince ibérico (Lynx pardinus) en España. Informe inédito. Ministerio de Medio Ambiente. Tragsa. Madrid. 2002.
3. Jubb, KVF; Kennedy, PC; Palmer N.: Pathology of domestic animals. Fourth Edition. Academic Press Inc. San Diego, 1993.
4. Theilen GH, Madewell BR.: Veterinary Cancer Medicine. Second Edition. Lea and Febiger. Philadelphia, 1987.
5. Johnson, W.E., Godoy, J.A., Palomares, F., Delibes, M., Fernández, M., Revilla, E., O’Brien, S.J.: Phylogenetic and Phylogeographic Analysis of Iberian Lynx Populations. J Hered. 95: 19-28, 2004.
6. O’Brien SJ.: A role for molecular genetics in biological conservation. Proc Natl Acad Sci USA 9: 5748-5755, 1994.
7. Sherding RG.: The cat. Diseases and clinical management. Second Edition. Philadelphia, 1994.
8. Bolton L A, Munson L.: Glomerulosclerosis in captive cheetahs (Acinonyx jubatus). Vet. Pathol. 36: 14-22, 1999.
