La paradoja de la aerobiosis

 

 LA PARADOJA DE LA AEROBIOSIS  ¿Por qué es tóxico el oxígeno?

Dra. María Cascales Angosto

Académica Numeraria de las Reales de Farmacia y Doctores

Introducción

El oxígeno molecular,  vital para la existencia de los organismos aerobios,  es inherentemente tóxico. Esta paradoja deriva de la misma naturaleza química del  oxígeno. Animales, plantas y muchos microorganismos cuentan con el oxígeno para una eficiente producción de equivalentes energéticos en forma de ATP.

 

La atmósfera de nuestro planeta fue anaerobia hasta el advenimiento del oxígeno hace unos 2.500 millones de años, como resultado de la rotura del agua en el proceso fotosintético de unas algas microscópicas cianofíceas. A partir de aquí y con el advenimiento de la fotosíntesis oxidativa, la acumulación progresiva del oxígeno hizo cambiar  la atmósfera desde predominantemente reductora (rica en hidrógeno) o neutra (CO2 y N2),  hasta  contener  un 21% del aire que respiramos. Esta progresiva elevación del oxígeno atmosférico estuvo  acompañada  por la formación de la capa de ozono en la estratosfera. Ambos oxígeno y ozono actuaron como filtros protectores de la intensa luz ultravioleta que llegaba a la Tierra procedente del Sol. En el Universo son el hidrógeno y el helio los elementos predominantes, siendo la Tierra un centro de oxidación en un medio reducido. Como el oxígeno es potencialmente tóxico su elevación en la atmósfera  hizo que los organismos anaerobios se encontraran sometidos a una presión de selección que presentaba la gran ventaja de mayor energía útil derivada de los alimentos para realizar transformaciones metabólicas, destoxificar numerosos compuestos e incluso para generar luz y calor. Estas ventajas tenían un precio, la necesidad de generar sistemas de defensa frente a la considerable toxicidad de este gas paramagnético. Aquellos organismos que tuvieron éxito en el desarrollo de las requeridas defensas pudieron sacar provecho de los beneficios y ello dio lugar a la enorme variedad de formas de vida aerobia tan evidentes hoy sobre la Tierra. Sin embargo, aquellos organismos que no pudieron acomodarse a la toxicidad del oxígeno evolucionaron como anaerobios microscópicos restringidos a nichos anaeróbicos.

 

El  lado perjudicial del oxígeno se relaciona directamente  con el hecho que cada átomo de oxígeno posee un electrón desapareado en su orbital externo y la molécula de oxígeno posee dos electrones desapareados en dos orbitales distintos, de manera que el átomo de oxígeno es un radical libre y la molécula de oxígeno un biradical libre. La reducción tetravalente concertada del oxígeno por la cadena de transporte electrónica mitocondrial para producir agua,  se considera un proceso relativamente seguro;  sin embargo, el ambiente reducido del medio intracelular proporciona amplias oportunidades para que el oxígeno sufra la reducción univalente que es la causante de la  generación de los intermediarios reactivos. El radical superóxido, el peróxido de hidrógeno y el radical hidroxilo son los subproductos de esta reducción univalente, denominados  especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species, ROS) y responsables de la toxicidad del oxígeno.

 

Para sobrevivir en este ambiente aerobio poco favorable, los organismos vivos han  desarrollado  una serie de sistemas enzimáticos y una variedad de compuestos antioxidantes hidro y liposolubles,  cuyo papel es secuestrar,  interceptar e inactivar   las ROS que se sintetizan inevitablemente.  La célula posee también  la capacidad de sintetizar una  serie de sistemas  enzimáticos reparadores/eliminadores de la lesión en proteínas, lípidos y DNA.  Como la intensidad del estrés oxidativo  puede variar de un momento a otro, los organismos pueden adaptarse al estrés fluctuante  induciendo en un determinado momento  la síntesis de enzimas antioxidantes y  reparadores cuya misión es evitar o eliminar  la lesión.

 

Teóricamente los problemas de la aerobiosis  terminarían aquí, pero desgraciadamente, la biología no es tan precisa. La realidad es que  a pesar que la célula posee  valiosos mecanismos antioxidantes y  reparadores que representan  una defensa eficiente frente a la agresión oxidativa,  en determinadas ocasiones estos mecanismos no son suficientes y el daño oxidativo permanece. El estrés oxidativo se ha visto involucrado en una amplia variedad de procesos degenerativos, enfermedades y síndromes que incluyen los siguientes: mutagenesis, aterosclerosis, infartos y lesiones derivadas de la isquemia/reperfusión, enfermedades crónicas inflamatorias, problemas agudos inflamatorios,  estrés fotooxidativo ocular, alteraciones del sistema nervioso central, y una amplia variedad de alteraciones relacionadas con la edad, incluyendo los mismos procesos del envejecimiento.

La naturaleza radical del oxígeno

 

El elemento oxígeno existe en el aire que respiramos en forma molecular O2. Fue descubierto, aislado y caracterizado independiennte por Priestley y Scheele en 1774 y poco to después Lavoisier describió que la inhalación del oxígeno podía presentar efectos tóxicos. Aunque se conoce desde hace décadas que la terapia del oxígeno puede resultar beneficiosa en muchas situaciones patológicas, los tratamientos prolongados pueden suponer un riesgo de toxicidad. Binger et al  (1927) reconocieron que los estudios clásicos de Bert en 1878 fueron el primer documento que stró que el oxígeno a elevadas concentración era un veneno potente, que conducía a convulsiones y a la muerte de gorriones y animales de laboratorio. En 1899 Lorrain Smith describió que elevadas tensiones de oxígeno producían congestiones pulmonares severas en ratones ratas y cobayas. Toda esta información ha sido ignorada a pesar de los numerosos estudios sobre la toxicidad del oxígeno que han circulado entre 1899 y 1945. La aceptación final de la toxicidad del oxígeno no llegó hasta 1967 cuando Nash et al., relacionaron la concentración y duración del oxígeno inhalado con la patología del pulmón. Ya en 1954 Gersman et al emitieron la hipótesis que el envenenamiento por oxígeno y la irradiación X tenían una base de acción común, que era a través de la formación de radicales libres de oxígeno.

 

La paradoja del oxígeno deriva de su  naturaleza de radical que le permite reacciones químicas de oxidación/reducción. En la reducción univalente el oxígeno  sufre cuatro sucesivas reducciones con un electrón, catalizadas por la citocromo oxidasa de la  cadena de transporte electrónico mitocondrial. En esta vía se generan los intermediarios reactivos siguientes: el primero es el radical superóxido  (O2.-),  resultante de la reducción del oxígeno molecular con un electrón; el segundo es la especie activa peróxido de hidrógeno (H2O2), resultante de la adición de un segundo electrón y dos protones; el tercero  es el radical hidroxilo (·OH), que posee una elevada reactividad,  resultante de la incorporación de un tercer electrón y un protón.  El cuarto electrón y otro protón genera la molécula de agua (Figura 1).

 

Figura 1.- Formación de especies reactivas de oxígeno por adición de electrones a la molécula de oxígeno

 

Es interesante destacar que el O2 y el O2.- son radicales de oxígeno (O2  es un biradical y O2.- es un monoradical), mientras que el H2O2, a pesar de ser una especie reactiva de oxígeno,  no es un radical ya que todos los electrones de su orbital externo se encuentran apareados. El radical hidroxilo (·OH) es una verdadera especie  radical. Las especies de oxígeno actúan como oxidantes biológicos, pero el    O2.- es un reductor suave, aunque la simple adición de un protón lo convierte en un agente oxidante activo (HO2·). Sin embargo, el potencial redox del ·OH a unos 1,77 V,  marca claramente a este radical como una especie muy oxidante. El oxígeno singlete (1 O2) no se genera por reacciones redox, sino por absorción de energía electromagnética,  la cual invierte transitoriamente el giro (spin) de uno de los dos electrones desapareados del oxígeno, de modo que los giros de los dos electrones desapareados muestran una orientación antiparalela. El oxígeno molecular, estado basal o triplete, es incapaz de aceptar dos electrones directamente, reducción bivalente, porque la adición de un par de electrones antiparalelos se encuentra restringida por  los giros paralelos del estado basal. El oxígeno singlete, sin embargo, con sus giros  electrónicos antiparalelos no tiene tales  restricciones en su reactividad y es muy buen oxidante bivalente frente a  muchas biomoléculas. La absorción de grandes cantidades de energía electromagnética por el oxígeno molecular para generar oxígeno singlete se encuentra restringida a acontecimientos fotoquímicos. El interés en el oxígeno singlete se  centra principalmente en aquellos relacionados con la química ambiental, biología vegetal y reacciones oxidativas en tejidos expuestos al medio ambiente, como la piel y el ojo. El oxígeno singlete es muy inestable y se convierte en oxígeno molecular, basal en estado triplete, con una vida media de 2 – 7 μsegundos, emitiendo luz en su descomposición.

 

La rotación de cargas eléctricas genera campos magnéticos. La mayoría de sustancias no se encuentran influenciadas por campos magnéticos porque  los electrones que poseen se encuentran en parejas de giro opuesto. El emparejamiento de electrones con giros opuestos neutraliza este efecto. Tales sustancias son diamagnéticas. Esto no ocurre con el oxígeno, que posee  espines electrónicos desapareados que tienen el mismo sentido de rotación. Esta estructura electrónica es paramagnética y constituye una barrera para la inserción de una pareja de electrones.

 

Toxicidad del oxígeno y estrés oxidativo

 

El 95% del oxígeno que respiramos sufre la  reducción secuencial  concertada con cuatro electrones para producir agua,  en una reacción catalizada por la citocromo oxidasa (citocromo c:oxígeno oxidoreductasa) del complejo IV de la cadena de transporte electrónico mitocondrial. La citocromo oxidasa es el aceptor de electrones terminal en la cadena y debe ceder sus equivalentes reductores al oxígeno  para poder continuar el transporte electrónico. Si se detuviese el flujo de electrones a través de la cadena respiratoria,  se disiparía la fuerza motora de protones y la síntesis del ATP no podría continuar. Por tanto, el papel principal del oxígeno en todos los organismos aerobios es actuar simplemente como un vertedero para los electrones. Por cada molécula de oxígeno que se convierte en agua se genera una energía de 105 kcalorías. Por tanto, la vida aerobia utiliza el oxígeno para oxidar sustratos ricos en carbono e hidrógeno (alimentos), con el objeto de obtener energía química  (ATP) y calor, esenciales para la vida. 

 

Aunque la cadena de transporte electrónico mitocondrial es un sistema muy eficiente, la naturaleza de la alternancia de las reacciones de oxidación/reducción monovalentes que cataliza (generando una constante y alternativa serie  de radicales enjaulados),  predispone a cada transportador de electrones a reacciones laterales  con el oxígeno molecular.

 

Figura 2.- Radical superóxido, peróxido de hidrógeno y radical hidroxilo: los tres subproductos de la reducción del oxígeno por la citocromo c oxidasa  de la cadena respiratoria mitocondrial.

 

Efectos lesivos del estrés oxidativo sobre las células.

Fue en 1954 cuando Gersman et al., describieron por primera vez, que los efectos tóxicos del oxígeno se debían a la formación de radicales libres de oxígeno. Posteriormente, la propuesta de McCord y Fridovich en 1969, acerca de que la formación de los radicales de oxígeno era una parte integral del metabolismo normal de la célula, no fue tomada muy en serio. Ya no existe duda de la participación de las especies reactivas del oxígeno en numerosos procesos fisiológicos y patológicos.

 


Los radicales libres se caracterizan por iniciar reacciones en cadena, reacciones autopropagadoras en las cuales un radical reactivo origina un producto que es también un radical y que a su vez reacciona y origina otro radical. Esta fase química se conoce como propagación y una última fase, terminación, es aquella en la que reaccionan dos radicales dando un compuesto no radical. Por tanto, las reacciones originadas por los radicales libres en sus reacciones en cadena, pueden dividirse en:

INICIACIÓN, PROPAGACIÓN y  TERMINACIÓN.

En las reacciones de iniciación, un radical se forma a partir de una especie química estable no radical:

AB + C è A· + B + C.

En la propagación, un radical libre reacciona con una molécula estable

A· + CD è AC + D·

En la terminación dos radicales libres comparten sus electrones desapareados y originan un producto estable:

A· + B· è AB

La reactividad química de los radicales libres se determina por la molécula que posee el electrón desapareado, por consiguiente, la reactividad varía enormemente entre los diferentes radicales libres. Una manera de expresar y comparar la reactividad química es evaluando la vida media (t1/2) de las especies químicas.

 

Tabla 1.- Vida media de radicales libres ene sistemas biológicos (Boveris, 1998)

 

 

Radical libre

 

               t1/2 segundos

 

Radical hidroxilo (·OH)

Radical alcoxilo (RO·)

Radical peroxilo (ROO·)

Óxido nítrico (NO·)

Ubisemiquinona (UQH·)

Melaninas (Complejo)

Semiquinonas (Complejo)

 

                  10-9

                  10-6

                  10-1

                  1 – 10

                  10-2

                  días

                  días

 

La vida media más corta la poseen los radicales de elevada reactividad, lo que indica que los radicales ·OH son los más reactivos. La formación de ·OH implica reacción con cualquier molécula orgánica cercana. Otras especies reactivas producidas en condiciones normales no son radicales libres, pero poseen elevada reactividad, como es el oxígeno singlete (1O2), estado de oxígeno excitado electrónicamente, con una vida media de 5 x 10-6 segundos, y el poderoso oxidante peroxinitrito (ONOO-) con vida media de 0,05 – 1 segundos

 

A pesar de su naturaleza biradical, la molécula de oxígeno es, desde el punto de vista químico, bastante estable y se ha descrito como radical perezoso. La mayoría de las biomoléculas aisladas, proteínas, azúcares, DNA y algunos lípidos son estables por largos períodos de tiempo en nuestra atmósfera. Sin embargo el oxígeno es bastante reactivo para combinarse con los átomos de hierro de la hemoglobina y la citocromo oxidasa (constantes de reacción de segundo orden 107-108 M-1 s-1), para proporcionar las bases químicas para el transporte y respiración del oxígeno.

 


Las mitocondrias, presentes en todas las células aerobias, son la fuente biológica más importante del anión superóxido que se dismuta, por acción de la superóxido dismutasa dependiente de manganeso (Mn-SOD), localizada principalmente en la matriz mitocondrial. La forma semiquinona de dos componentes de la cadena respiratoria mitocondrial, la ubisemiquinona y la flavin semiquinona de la NADH- deshidrogenasa, producen O2.- por autooxidación en una reacción vectorial dirigida a la matriz mitocondrial. El radical superóxido no  puede atravesar la membrana mitocondrial interna y se encuentra confinado en la matriz donde la Mn-SOD y el NO·  son los agentes que reaccionan con él dando lugar a peróxido  de hidrógeno y peroxinitrito como productos finales, respectivamente, en dos reacciones muy rápidas controladas por difusión. La producción mitocondrial de O2.- se cifra en condiciones normales, en un 2% del oxígeno total incorporado por la mitocondria en hígado y corazón perfundidos de rata.

 

El retículo endoplásmico, por autooxidación de la flavoproteína NADPH citocromo P450 reductasa  y el citocromo P-450, produce O2.- y H2O2. En hepatocitos, por ejemplo, su bien desarrollado retículo endoplásmico a través de  sus monooxigenasas de función mixta,  proporciona otra fuente importante de anión superóxido. Los peroxisomas generan H2O2 en el núcleo del peroxisoma por transferencia de dos electrones desde las flavina oxidasas al oxígeno.

 

La NADPH oxidasa, ubicada en la membrana de las vacuolas fagocíticas, genera cantidades importantes de radical superóxido cuando los fagocitos (neutrófilos y macrógagos) se activan por causas patológicas. Este sistema fagocítico, al ser activado,  experimenta el denominado “estallido respiratorio”, en el que se generan grandes cantidades de radical superóxido  a partir del oxígeno molecular y electrones derivados de equivalentes reductores en forma de NADPH procedentes de la vía de las pentosas:

 

 2O2 + NADPH     ®     2O2 .-  + NADP+ + H+

 

La NADPH oxidasa cuenta con la participación de un complejo de proteínas, que por estrés oxidativo sufren modificaciones conformacionales, exponiendo distintos sitios de interacción proteica, que le permiten unirse a 2 ferroproteínas integrantes de membrana. De esta manera queda formado un complejo proteico con actividad NADPH-oxidasa, cuya activación  está mediada por el sistema Ras.

Los radicales de oxígeno producidos por la  NADPH oxidasa, contribuyen a la destrucción de agentes infecciosos de modo directo, o se combinan con haluros en presencia de la mieloperoxidasa dando lugar a agentes más reactivos, como el hipoclorito y oxígeno singlete (1O2). Aunque la producción de radicales libres de oxígeno por los fagocitos es útil para el organismo, en muchos procesos patológicos se produce infiltración secundaria de estas células del sistema inmune en los órganos afectados y son causa de un mayor agravamiento de la lesión. En nuestras investigaciones hemos observado que el bloqueo de la actividad de las células de Kupffer, macrófagos residentes en hígado,  previo a la inducción de una lesión hepática por un agente hepatotóxico, disminuyó de manera significativa la intensidad de la lesión hepática y la formación de peróxidos.

 

Otra fuente de ROS está relacionada con la xantina oxidasa, presente en el citosol. La acumulación de hipoxantina y xantina, bajo condiciones anaeróbicas, de isquémia/ reperfusión o de bajo contenido energético, puede desembocar en la producción de ROS, según la siguiente cascada de reacciones:

Xantina deshidrogenasa + ATP + NAD+è Xantina oxidasa  (XO)+ AMP + NADH + H+

Hipoxantina è Xantina   

Xantina + XO è ácido úrico + H2O2 + O2.-

.

Figura  3. Sistemas celulares que generan especies reactivas de oxígeno

 

El radical libre de nitrógeno


La molécula de nitrógeno se encuentra presenta en la atmósfera que respiramos en un 79% y está formada por dos átomos de nitrógeno que como átomo libre posee tres electrones desapareados (1s2, 2s2, 2px, 2py y 2pz), que forman tres enlaces covalentes completos (σ y 2π)  en la estable e inerte molécula de N2. Cuando un átomo de N con sus tres electrones desapareados, se combina con un átomo de oxígeno con sus dos electrones desapareados, la molécula resultante, NO, posee un número impar de electrones. Se forma un doble enlace completo N=O y el electrón desapareado y deslocalizado es el que le da el caracter de radical libre al NO·. El NO· es un radical libre desde el punto de vista físico por poseer un electrón desapareado, pero su carácter de radical libre químico es restringido porque no se le conoce ninguna reacción de propagación en sistemas condensados. Sin embargo, el NO· reacciona fácilmente con el O2.- para formar peroxinitrito en una reacción clásica de terminación.

 

 

 

 Reacción en cadena de las especies reactivas de oxígeno (ROS)

 

(a) Reacción de Fenton-Haber-Weis

La producción primaria de O2.- y H2O2 es capaz de iniciar y sostener una reacción en cadena en condiciones fisiológicas que abarcan las reacciones de lipoperoxidación. Las especies O2.- y H2Oson los reactivos responsables de los procesos de iniciación de las reacciones siguientes:

O2.-  + Fe3+ ===> O2 + Fe2+

H2O2 +  Fe2+ ===> ·OH + Fe3+ + HO

En esta última  reacción  se genera ·OH y se denominan de Fenton-Haber Weiss quienes describieron originalmente la descomposición del peróxido de hidrógeno por sales de hierro.  La acción protectora de la SOD y la catalasa, al eliminar el  H2O2   se comprende que mantenga baja la tasa de generación del ·OH.  Este concepto se ha reconocido como el dogma Fridovich del efecto antioxidante de ambos SOD y catalasa. El ·OH es capaz de iniciar las reacciones de propagación con ácidos grasos no saturados (RH) para generar hidroperóxidos estables, según las reacciones:

·OH + RH ===> R· + H2O

R· + O2 ===> ROO·

ROO· + RH ===> R· + ROOH

Los radicales peroxilos (ROO·) son capaces de sufrir reacciones de terminación con la formación de productos excitados electrónicamente, como el oxígeno singlete (1O2), aldehidos (ROH) y cetonas (RO), con grupos carbonilo excitados (= C*):

ROO· + ROO· ===> RHO + RO + 1O2

ROO· + ROO· ===> =CO* + RO+ O2

Estas reacciones y la siguiente:

 1O2 + 1O2  ===> 2O2 + hυ


proporcionan, a través de quimioluminiscencia, las bases químicas y moleculares de un ensayo para determinar la tasa de reacción de lipoperoxidación por radicales libres en condiciones fisiológicas.

 

(b) Reacciones del radical libre de nitrógeno

El reconocimiento de la producción de óxido nítrico, por la óxido nítrico sintasa constitutiva (cNOS) del endotelio, como factor relajante del endotelio (ERF) y de la reacción del anión superóxido con el óxido nítrico, ha abierto un nuevo campo en la bioquímica de los radicales libres. El  descubrimiento de la producción de NO· por una NOS mitocondrial (mtNOS),  localizada en la membrana interna de la mitocondria,  ha supuesto una revolución en términos, tanto de la regulación de la incorporación de oxígeno por los tejidos, como de la toxicidad de los radicales libres. El NO· está producido por una serie de NOS, la constitutiva (cNOS), la inducible (iNOS) y la mitocondrial (mtNOS), que comparten la propiedad común de utilizar arginina y NADPH como sustratos, según la reacción:

arginina + NADPH  ==>  citrulina + NADP+ + NO·

La reacción entre el anión superóxido y el óxido nítrico se comprende fácilmente si se considera que una colisión entre dos moléculas con electrones desapareados y deslocalizados, que dan lugar a la formación de enlace, tiene que ser mucho más rápida que una colisión molecular.

NO· + O2.-  ==> ONOO-

El ONOO- es además capaz de sustraer átomos de hidrógeno de los ácidos grasos insaturados y de generar ·OH, e iniciar las reacciones de propagación de la peroxidación lipídica:

ONOO- + RH + H+ ==> NO2 + H2O + R·

  El estrés oxidativo

El estrés oxidativo es un estado de la célula en la cual se encuentra alterada la homeostasis óxido-reducción intracelular,  que  se produce a causa de una excesiva producción de especies reactivas de oxígeno  y/o por deficiencia en los mecanismos antioxidantes, conduciendo a daño celular.

El estado de óxido – reducción de la célula está determinado por el equilibrio entre las parejas de óxido-reducción de los distintos compuestos biológicos presentes en ella, principalmente de aquellos que se encuentran en mayor proporción. El  glutation (GSH, g-L-glutamil-L-cisteinil-glicina), debido a su alta concentración intracelular (5-10 mM), se considera un regulador homeostático del estado de óxido- reducción celular. Este metabolito predomina ampliamente su forma reducida (GSH) sobre la oxidada (GSSG). Esto trae como consecuencia que un ligero desplazamiento del equilibrio hacia la forma oxidada afecta de manera alarmante el estado de óxido-reducción general, debido a su participación en muchos equilibrios de óxido reducción acoplados. En particular esto es crítico para la regulación  de algunos factores de transcripción , cuya actividad depende del estado de óxido-reducción en el que se encuentren. Cuando un grupo -SH crítico sufre una modificación oxidativa la proteína afectada puede perder su funcionalidad.

Sistemas de defensa antioxidante

La vida en presencia del oxígeno molecular exige contar con una batería múltiple de defensa contra los diversos radicales libres de oxígeno, que por un lado tiendan a impedir su formación y por otro, los neutralicen una vez formados. Halliwel define como antioxidante a toda sustancia que hallándose presente a bajas concentraciones con respecto a las de un sustrato oxidable (biomolécula), retarda o previene la oxidación de dicho sustrato. El antioxidante al colisionar con el radical libre le cede un electrón oxidándose a su vez y transformándose en un  radical  débil no tóxico y que en algunos casos como la vitamina E, puede regenerarse a su forma primitiva por la acción de otros antioxidantes. No todos los antioxidantes actúan de esta manera, los llamados enzimáticos catalizan o aceleran reacciones químicas que utilizan sustratos que a su vez reaccionan con los radicales libres.

 

De las numerosas clasificaciones de los antioxidantes, se recomienda adoptar la que los divide en: exógenos y endógenos. Si bien todos los organismos vivos soportan numerosos factores endógenos y exógenos que promueven la situación de  estrés oxidativo, al mismo tiempo poseen numerosos sistemas de defensa antioxidante regulables, enzimáticos y no enzimáticos.

Existen enzimas que actúan específicamente sobre determinadas especies reactivas. Así, la superóxido dismutasa elimina el radical superóxido con formación de peróxido de hidrógeno:

O2-.è O2 +  H2O2,

la catalasa transforma al peróxido de hidrógeno en agua:

H2O2è  O2 +  H2O

la  GSH–peroxidasa cataliza la reducción de peróxidos (ROOH, inclusive al H2O2) a alcoholes (ROH), aprovechando el potencial reductor del GSH.

 H2O2 +  2GSH è 2 H2O  +  GSSG

Existen otras enzimas, tales como las quinonas reductasas y hemo oxigenasa, que pueden también prevenir la formación de ROS.

La familia de las superóxido dismutasas (SOD) cuenta con dos proteínas inicialmente detectadas, la Mn SOD mitocondrial y la Zn/ Cu- SOD citoplasmática, que dan cuenta del 100% de la actividad SOD intracelular. La Cu,Zn SOD citosólica, se inhibe  por cianuro, su actividad representa el 90% de la actividad total. La MnSOD, mitocondrial se puede determinar por diferencia entre la actividad   total y la actividad SOD en presencia de cianuro.

Algunos metales, tales como el Se y el Zn, por su participación como cofactores de enzimas antioxidantes (GPX y SOD citoplasmática, respectivamente), contribuyen a aumentar las defensas antioxidantes.

La catalasa se encuentra en todos los órganos, pero especialmente en el hígado y en los eritrocitos. Localizada principalmente en peroxisomas, es una hemo proteína, que tiene asociada una molécula de NADPH para estabilizar la molécula.

 

Papel del glutation en la respuesta antioxidante

Entre las defensas antioxidantes no enzimáticas, tiene un lugar predominante el glutation (GSH).  Este tripéptido protege a la célula frente a las diferentes especies oxidantes y se ha comprobado su participación clave en numerosas enfermedades neurodegenerativas. Tanto el GSH como otras moléculas que contienen grupos -SH, tienen alto poder reductor y poseen propiedades antioxidantes, ya que pueden cederle un electrón a las ROS, disminuyendo de esta forma su reactividad. Se dice que este tipo de compuestos de bajo peso molecular actúan como “atrapadores” de radicales libres. Entre ellos podemos citar a la tiorredoxina y a la vitamina C o ácido ascórbico (hidrosoluble) y a las vitaminas liposolubles E o alfa tocoferol (unida a membrana) y la A. 

La GSH reductasa dependiente de NADPH, contribuye a las defensas antioxidantes, actuando en la regeneración del glutation a su estado reducido. La tiorredoxina reductasa y algunas proteínas, tales como las metalotioneina, ricas en residuos cisteínas, también participan en la restauración de los niveles de GSH reducido.

Además de los mecanismos de protección antioxidante, enzimáticos y no enzimáticos, existen otros mecanismos que también contribuyen a paliar el posible daño oxidativo. En el complejo  IV de la cadena respiratoria, la presencia de los citocromos a-a3 proporciona 4 sitios de transferencia de electrones para hacer más efectiva dicha transferencia y justamente allí no hay formación de ROS. En tanto que en los otros sitios a lo sumo hay una pérdida del 4%, debido a que la suma de los potenciales de los distintos sistemas de reducción  es francamente positivo, tirando el equilibrio hacia la derecha (complejo I  complejo  III complejo IV). 

Radicales de oxígeno como segundos mensajeros

Todas las células aerobias producen constitutivemente radicales de oxígeno y pequeñas cantidades de estos radicales se liberan por varios tipos celulares cuando son estimuladas por el factor de necrosis tumoral (TNFα) la interleuquina 1 (IL-1) y los ésteres del forbol. Todos ellos activan una forma citoplasmática del factor de transcripción NFκB que resulta al eliminar una subunidad proteica inhibidora IκB. Esta activación se inhibe por agentes que eliminan radicales de oxígeno y puede recuperarse mediante exposición a un débil estrés oxidativo.

 

Cada tipo celular genera especies reactivas de oxígeno de forma constitutiva, que en determinados casos pueden producirse en cantidad suficiente como para llegar a ser tóxicas. Algunas células sanguíneas, por ejemplo, son forzadas a sintetizar radicales de oxígeno durante la inflamación aguda crónica. Pacientes que sufren artritis reumatoide producen elevadas cantidades de ROS en sus articulaciones y estos radicales son causa directa de los síntomas de esta enfermedad crónica porque los agentes que inhiben su producción son fármacos antiinflamatorios potentes.

 

En estudios sobre los efectos de los radicales de oxígeno en cultivos celulares, se ha observado que una célula puede sufrir la agresión oxidativa débil o citotóxica dependiendo de la dosis de las especies de oxígeno que se generan. En el caso citotóxico se observa alteración de las proteínas, proteolisis, fragmentación del DNA y lipoperoxidación que conducen a la lisis celular.

 


Los ROS  abarcan  el anión  superóxido (O2.-),  peróxido de hidrógeno (H2O2), radical hidroxilo (·OH) y oxígeno singlete (1O2). Estos diversos tipos de ROS pueden reaccionar entre ellos en presencia de metales, cobre o hierro y también dar lugar a productos reactivos secundarios como peróxidos lipídicos e hipoclorito. A lo largo de la evolución han surgido sistemas enzimáticos ubicuos, especializados en la eliminación de estos intermediarios entre los cuales se incluyen las superóxido dismutasas (MnSOD y Cu,ZnSOD)), la catalasa y la glutation peroxidasa (Figura 4).

 

 

Figura 4.- Eliminación de las especies reactivas de oxígeno por los sistemas de defensa antioxidante. La acción concertada de estos sistemas: SOD, catalasa y glutation peroxidasa se encuentra complementada por una serie de antioxidantes endógenos (GSH) y exógenos (Vitamina E).

 

Los ROS no solo son producidos como agentes citotóxicos por células especializadas en condiciones patológicas, sino tambien se generan en cada tipo celular como subproductos de las reacciones de transferencia electrónica. La mitocondria es la fuente principal de formación del radical superóxido, radical poco reactivo que se difunde rápidamente por la célula hasta que encuentra una reacción apropiada. Este  radical se origina por transferencia de un electrón al oxígeno molecular. Para la eliminación rápida del superóxido la mitocondria contiene su propia superóxido dismutasa, sistema enzimático inducible, dependiente de manganeso.

 

Figura 5.- Especies activas de oxígeno como segundos mensajeros.

 

 

El H2O2 no es un radical de oxígeno, pero puede servir como precursor de ellos. Se produce intracelularmente por los peroxisomas y la mitocondria y puede difundirse en el interior de las células desde el espacio extracelular a partir de células especializadas que lo producen en grandes cantidades durante la inflamación. Las ROS intracelulares proceden, por tanto, de una producción intracelular incrementada, del H2O2 extracelular o por inhibición de los enzimas que los eliminan.

 

Los granulocitos y los macrófagos poseen un sistema enzimático de membrana denominado NADPH oxidasa que puede producir el radical superóxido a partir del NADPH y oxígeno en respuesta a un estímulo apropiado. La inducción de este enzima se controla por la proteina quinasa (PKC), enzima que se activa por los ésteres del forbol dando lugar a la formación de ROS. Existen pruebas evidentes que demuestran que el éster del forbol PMA (phorbol 12-miristato 13-acetato) requiere la producción de ROS, ya que el efecto promotor del PMA es dependiente de estado prooxidante de las células.

 

La citoquina inmunomoduladora TNFα (Tumor Necrosis Factor alfa) puede inducir la síntesis de otras citoquinas en linfocitos T y en macrófagos activando los respectivos genes. Sin embargo, el TNFα  es  citotóxico  sobre otras líneas celulares no linfoides y en estos casos la  citotoxicidad depende, en parte, de las ROS,  porque se ha observado que la superexpresión de la SOD y la disminución de la presión parcial de oxígeno protegen a estas células de los efectos citotóxicos del TNFα.

 

La unión del TNFα a las células, como también el PMA y la IL1 inducen la síntesis de especies reactivas de oxígeno, lo cual demuestra que la concentración intracelular de estas especies se eleva durante la estimulación fisiológica  de las células por las citoquinas. Los radicales de oxígeno nos llevan a considerarlos como segundos mensajeros ya que su concentración se eleva por acción de un ligando extracelular. Además existe una reacción intracelular de transducción de señales que es provocada específicamente por los radicales de oxígeno. La forma citoplasmática del factor de transcripción inducible, el NFκB (factor nuclear  κB) es un objetivo fisiológico importante para los ROS. (Figura 3).  Estas ROS son las que promueven la separación del IkB…

 

 Evaluación experimental de las ROS

 


Debido a la gran reactividad de las ROS y a su escasa vida media, estas especies no han podido ser detectadas experimentalmente hasta el advenimiento de las técnicas de citometría de flujo y microscopía confocal. Estas técnicas han permitido mediante el uso de un amplio número de moléculas fluorescentes, detectar  específicamente las ROS en el momento de su generación en las células vivas. La correcta  aplicación de estos marcadores fluorescentes ha permitido observar y evaluar una serie de  funciones dinámicas celulares con gran precisión. Algunas funciones o estructuras celulares pueden ser estudiadas sin necesidad de incorporar marcadores fluorescentes exógenos, puesto que se pueden relacionar con la presencia de moléculas fluorescentes endógenas o con interacciones físicas específicas entre las células y la luz.

 

La citometría de flujo utiliza células vivas para el análisis de la actividad oxidativa celular. Este análisis puede ser complicado por la posibilidad de hallar múltiples formas de oxígeno reactivo en la misma célula. Además el óxido nítrico puede producir los mismos cambios en las propiedades ópticas del fluorocromo utilizado, iguales a las producidas por otras moléculas que reaccionan con el oxígeno. El uso de agentes bloqueantes e inhibidores de enzimas puede ayudar a dilucidar la especie responsable del cambio óptico producido en la sonda.

 

La dificultad del análisis cuantitativo de las especies reactivas de oxígeno se debe principalmente a tres razones: (a) a la concentración variable de metales que puede catalizar o inhibir reacciones de los radicales libres; (b) a la elevada concentración intracelular de glutation, el cual puede formar radicales tiol o sulfinilo o atrapar o reducir las ROS y (c) a  la presencia de otros agentes colectores de radicales libres, como la espermina.

 

La rodamina, la fluoresceína y otros fluorocromos pueden ser reducidos químicamente a sus formas  no fluorescentes. Estos derivados reducidos se oxidan  fácilmente, por algunas especies de oxígeno reactivas, a su forma fluorescente. De esta forma pueden utilizarse como pruebas fluorogénicas para detectar la actividad oxidativa en células y tejidos. Los fluorocromos más utilizados en citometría de flujo para la detección del estrés oxidativo son los siguientes: la rodamina 123 (Rh123), la diclorofluoresceína (DCF) y el hidroetidio (HE) entre otros.  El diacetato de 2´, 7-dihidro dicloro fluoresceína H2DCF-DA se utiliza para detectar los peróxidos  en neutrófilos y macrófagos y para detectar el estrés oxidativo en fenómenos toxicológicos en hepatocitos, así como para caracterizar el estrés oxidativo dependiente de la hipoxia en levaduras y para observar efectos de la isquemia/reperfusión en pulmón y tejido cardiaco. La  DCF se excita a 488 nm y emite a 530 nm. El H2DCF reacciona con el peróxido de hidrógeno intracelular, mediante la acción de peroxidasas, citocromo c o Fe 2+. De hecho se utiliza como sustrato fluorescente para detactar y evaluar los peroxidos. El hidroetidio se utiliza específicamente para detectar y evaluar la generación de radical superóxido, se usa habitualmente para analizar el estallido respiratorio de los fagocitos. Se ha observado en células no linfoides que su fluorescencia depende de la cantidad de radical superóxido producido por la NADPH oxidasa ligada a la membrana de la mitocondria. El HE citosólico muestra una fluorescencia azul, pero una vez oxidado a etidio, se intercala en el DNA celular y cambia a fluorescencia roja. El HE y el H2DCF se utilizan conjuntamente para estudios de estrés oxidativo.

 


La microscopía confocal permite la visualización directa de la producción de radicales libres mediante la utilización de los mismos fluorocromos utilizados  para la citometría de flujo, que reaccionan con ellos de forma específica dentro de la célula.  El diacetato de  diclorodihrofluoresceína, antes mencionado,  es el fluorocromo más utilizado para detectar el  peróxido de hidrógeno específicamente, ya que no es capaz de reaccionar con el anión superóxido, mientras dihidroetidio es además capaz de reaccionar con el radical superóxido.

 

El H2DCF-DA es un compuesto apolar que se incorpora a las células donde se convierte en diclorodihidrofluoresceína (H2DCF) por acción de unas esterasas intracelulares. El H2DCF no presenta fluorescencia, pero al ser oxidado por el peróxido de hidrógeno (no por el anión superóxido)  se convierte en fluoresceína (DCF) altamente fluorescente (verde).

 

H2DCF-DA + esterasas è H2DCF + peróxidos è DCF (verde)

 

Experimentos en nuestro laboratorio sobre mecanismos de hepatotoxicidad producidos por fármacos, han permitido detectar y evaluar  los niveles intracelulares de peróxidos utilizando  H2DCF-DA. La Figura 5  muestra por microscopía confocal, las imagenes de cultivos primarios de hepatocitos de rata incubados en presencia de cantidades crecientes de cocaína (0 – 1000 μM) después de haber sido tratados con H2DCF-DA. En la fotografía aparecen en verde brillante sobre fondo negro las células viables que han generado  peróxidos al ser incubadas con cocaína, los cuales  han reaccionado con el fluorocromo. La fluorescencia roja se debe al yoduro de propidio,  que se intercala en las cadenas de DNA y es un índice de células no viables. 

 

Figura 6.- Análisis por microscopía confocal de la producción de peróxidos. Imágenes obtenidas al incubar hepatocitos de rata con cocaína (0, 50, 500, 1000 μM )  durante 24 horas  y con yoduro de propidio y diacetato de dihidrodiclorofluoresceína  (H2DCH-DA) durante 30 minutos (A) control; (B) cocaína 50 μM; (C) cocaína 500  μM  y (D) cocaína 1000 μM. El mayor contenido en peróxidos se muestra en las células incubadas con cocaína 50 μM. En C y D las manchas en rojo debidas el yoduro de propidio, indica la existencia de células nmuertas (Zaragoza et al., 2000).

 

Otro ejemplo obtenido en nuestro laboratorio   ha sido la evaluación del anión superóxido en cultivos primarios de hepatocitos incubados en presencia de ciclosporina A (CsA). En este caso el fluorocromo elegido fue el hidroetidio, selectivo del anión superóxido.  La Figura 6 corresponde a las imagenes  de cultivos primarios de hepatocitos, obtenidas por microscopía confocal, a las 24 horas de incubación de con cantidades crecientes de CsA (0 – 50 μM) después de haber sido tratados con el fluorocromo hidroetidio (HE). Estos resultados indican que la célula en condiciones normales genera anión superóxido, que la concentración de este ión se eleva frente a concentraciones bajas de CsA,  y que disminuye en las condiciones de mayor toxicidad por la pérdida de la viabilidad de las células en el cultivo.  

 


 

Figura 7.-.Análisis por microscopía confocal de la producción de peróxidos. Imágenes obtenidas al incubar hepatocitos de rata con ciclosporina A (0, 5,  25 y 50 μM)  durante 24 horas  y con hidroetidio (HE)  durante 30 minutos. (A) control, (B) ciclosporina A5 μM, (C) ciclosporina A 25 μM  y (D) ciclosporina A 50 μM. El color rojo en el interior de las células se corresponde con la cantidad de radical superóxido (Andrés et al., 2000).

 

Conclusiones y respuesta adaptativa al estrés oxidativo

 

La integridad y la existencia de un organismo vivo dependen de la regulación de su propia homeostasis,  por tanto la supervivencia de una célula requiere el mantenimiento continuado de la homeostasis celular. En condiciones fisiológicas normales la homeostasis celular se encuentra continuamente agredida por agentes exógenos y endógenos. Para hacer frente a estos agresores, la célula ha desarrollado su propia protección o mecanismos de defensa, que implican la movilización de constituyentes celulares y la integración funcional de componentes específicos de defensa, entre los que se incluyen enzimas, tanto los asociados a membrana como los solubles citosólicos, que neutralizan los radicales libres.  Estos sistemas enzimáticos regulan los efectos perjudiciales de los agentes estresantes externos, aminoran las alteraciones del medio celular interno y preservan la actividad celular.

 

El funcionamiento de estos antioxidantes es más eficiente cuando las actividades de sus componentes individuales actúan coordinadamente. Para conseguir el mayor grado de efectividad las defensas antioxidantes coordinadas pueden, a su vez,  actuar de manera concertada con los sistemas celulares de reparación  dedicados a restaurar las moléculas alteradas por oxidación.

 

La respuesta adaptativa se refiere a la capacidad de un organismo o una célula de resistir a los efectos perniciosos de un agente agresivo,  cuando éste se ha administrado previamente a pequeñas dosis. Es este un fenómeno ampliamente distribuído entre todos los seres vivos y entre los agentes agresivos que inducen la respuesta adaptativa,  cabe destacar: el estrés oxidativo, el choque térmico, la radiación, agentes alquilantes, metales pesados, etc. La adaptación  implica la modulación de la expresión de una serie de genes.

 

A nivel fisiológico, el beneficio principal de la respuesta celular adaptativa está claro: proteger a la célula y al organismo de la agresión infligida por agentes extraños. Tal respuesta protectora indica que la célula, una vez expuesta al agente agresor, está preparada para hacer frente a una dosis subletal de dicho agresor. Aunque los primeros estudios sobre la respuesta adaptativa, implicaron a los mecanismos de resistencia adquirida,  la relevancia fisiológica de las respuestas adaptativas son de naturaleza más sutil. Por ejemplo, se ha demostrado que el ejercicio físico, que implica una elevación en la situación de estrés oxidativo, conlleva una reducción en la tasa de peroxidación lipídica producida durante el ejercicio. Los linfocitos de las personas expuestas por su trabajo a dosis bajas de radiaciones ionizantes muestran una capacidad más elevada de reparación. 

 

Se ha demostrado, tanto en bacterias como en eucariotas, que las células pueden sufrir una respuesta adaptativa frente la concentraciones subletales de oxidantes. En situaciones de estrés oxidativo, es importante constatar, que las células presentan dos líneas defensivas. La primera implica  sistemas enzimáticos antioxidantes involucrados directamente en la prevención de la lesión oxidativa, como la superóxido dismutasa, la catalasa y la glutation peroxidasa, y  moléculas antioxidantes de bajo peso molecular, como el glutation y el ascorbato. La segunda línea defensiva consiste en los enzimas reparadores que eliminan o reparan las moléculas lesionadas por oxidación.

 

Bibliografía

 

Alvarez Barrientos A, Callaghan R y O´Connor Blasco JE (1997) Análisis del estrés oxidativo por citometría de flujo. En: Bioquímica y fisiopatología del estrés oxidativo. (Ed M Cascales) Real Academia Nacional de Farmacia. Madrid. pp 365-380 pp 337-363


 

Andrés D,  Sanz N,  Zaragoza A,  Alvarez A y  Cascales M (2000) Developmental changes in antioxidant defence sys induced by cyclosporine a in rat hepatocyte cultures. Biochem Pharmacol 59, 1091-1100.

 

Andrés D,  Sanz N, Alvarez AM, Díez-Fernández C, Zaragoza A y Cascales M (2000)  HSP-70 induction by CsA in cultured hepatocytes. Effect of vitamin E succinate. J Hepatol  33,  570-579. 

 

Andrés D, Sanchez Reus MI, Bautista M y Cascales M (2003) Depletion of Kupffer cells by gadolinium chloride attenuates thioacetamide-induced hepatotoxicity. Expression of metallothionein and HSP70. Biochem Pharmacol 66, 917-926.

 

Andrés D, Díez-Fernández C, Castrillo A y Cascales M  (2002) Activation of heat shock factor is accompanied by the suppression of nuclear factor kB activity in rat hepatocyte cultures treated with cyclosporine A Biochem Pharmacol 64, 247-256.

.

Andrés D, Díez-Fernández C y Cascales M (2002) Novel mechanism of vitamin E protection against cyclosporine A cytotoxicity in cultured rat hepatocytes. Biochem Pharmacol  64, 267-276.

 

Ames, N.B., Shigenaga, M.K. y Hagen, T.M. (1993) Oxidants, antioxidants and the degenerative diseases of aging. Proc Natl Acad Sci USA 90, 7915-7922

 

Boveris A (1998) Biochemistry of free radicals: from electrons to tissues Medicina (Buenos Aires)  58, 350-356

 

Barja G (1997) Radicales libres y antioxidantes. En Bioquímica y Fisiopatología del Estrés Oxidativo (M. Cascales, ed) Real Academia Nacional de  Farmacia & Fundación J Casares Gil. Madrid.  pp 231-44.

 

Binger CAL, Faulkner JM y Moore RN (1927) Oxygen poisoning in mammals. J Exp Med 45, 849-864.

 

Callaghan RC, O´Connor JE y Alvarez-Barrientos A (1997) Microscopía confocal y Estrés Oxidativo. En: Bioquímica y fisiopatología del estrés oxidativo. (Ed M Cascales) Real Academia Nacional de Farmacia. Madrid. pp 365-380

 

Carrizo PH, Dubin M y Stoppani AOM (1998) Efectos fisiopatológicos del óxido nítrico y su relación con el estrés oxidativo. Medicina (Buenos Aires) 58, 367-373

 

Cascales M. (1999) Estrés Oxidativo, Envejecimiento y Enfermedad. Instituto de España. Madrid. ISBN 84-85559-54-1.

 

Cerutti, P.A. (1994) Oxy-radicals and cáncer. Lancet 344, 862-863

 

Crawford DR y Davies KJA (1994) Adaptative response and oxidative stress. Environ Health Perspect 102 (suppl 10) 25-28

 

Davies KJA (1995) Oxidative stress: the paradox of aerobic life. En Free Radicals and Oxidative Stress: Environmental, Drugs and Food aditives (ed Rice-Evans C, Halliwell B y Lunt GG). Biochem Soc Symp 61, 1-31. Gran Bretaña