1. CONSERVACIÓN DEL SEMEN

            Actualmente, la IA se tiende a realizar mediante la utilización de semen congelado, teniendo un importancia mucho menor el uso del semen fresco o refrigerado, esto es debido a las grandes ventajas que presenta la criopreservación del material seminal sobre los demás sistemas de conservación seminal, como son:

q       Conservación prácticamente indefinida en el tiempo

q       Eliminación de riesgos sanitarios

q       Racionalización económica del eyaculado

q       Recogida de semen sólo en épocas reproductivas favorables

q       Facilitar el testaje de los venados

q       Permite el comercio internacional de dosis

Por tanto, en este apartado de conservación seminal, centraremos principalmente nuestro estudio en el procesado y obtención de las dosis seminales congeladas. Los medios de congelación empleados para el semen de ciervo poseen los mismos componentes que los usados en el resto de rumiantes. Así, Krzywinski (1987) desarrolló un medio de congelación constituido por glicerol, fructosa, citrato y leche descremada. Por otro lado, Jacobson et al., (1989) emplearon un medio compuesto por citrato, fructosa, Tris, yema  de huevo y glicerol. Los niveles de glicerol utilizados más frecuentemente por los diferentes autores para la formulación de medios crioprotectores para el semen de ciervo están entre el 6 y el 8%.

            Por otro lado, y en lo que concierne a la congelación del semen de gamo, Mulley et al., (1988) desarrollaron un medio crioprotector a base de Tris,  glucosa, ácido cítrico, glicerol y  yema de huevo, congelando el semen en forma de píldoras de 0,1ml que contenían unos 100 millones de espermatozoides.

En cuanto a la técnica de congelación, mencionar que se sigue la misma desarrollada  para la congelación del semen de otros rumiantes. Así,  para el envasado de las dosis en pajuelas, se realiza una dilución con la primera fracción del diluyente (la cual no suele llevar glicerol) a temperatura ambiente, depositándose el semen parcialmente diluido en una cámara de refrigeración a 5ºC, para que alcance dicha temperatura en dos horas. A continuación, y una vez que el semen ha alcanzado los 5ºC, se añade la segunda fracción del diluyente (glicerolada) de forma fraccionada. Después de equilibrarse la muestra seminal a 5ºC durante unas dos horas, se procede al llenado de las pajuelas que a continuación son congeladas sobre vapores de nitrógeno líquido, lo cual permite una congelación suave y controlada hasta los -100ºC. Posteriormente, las dosis se almacenan definitivamente en nitrógeno líquido hasta su empleo. La metodología general anteriormente descrita puede experimentar diversas modificaciones según las recomendaciones de los diversos autores.

            La descongelación de las dosis se realiza frecuennte en un baño térmico a 37ºC. Una vez descongeladas las dosis y antes de su utilización definitiva para la IA, es necesario evaluar la calidad de las mismas con objeto de evitar elleo de dosis de mala calidad a la  post-descongelación. Así, normalmente se suelen evaluar el porcentaje de espermatozoides móviles y el porcentaje de células espermáticas con acrosomas intactos, ya  que ambos parámetros son buenos indicadores  de la fertilidad in vivo. Los diluyentesleados para la congelación del n de ciervo han sido muchos, aportando resultados de viabilidad celular in vitro y fertilidad muy variables. Así, uno de los primeros intentos por congelar células espermáticas de ciervo, fue realizado por Jaczewski et al., quienes recolectaron n de ciervo rojo por electroeyaculación y lo criopreservaron mediante elleo de diluyentes diseñados para congelar n de toro y macho cabrío. Posteriormente,  Graham et al. (1978), utilizaron medios con rafinosa, lactosa y leche desnatada. Más tarde, selearon otros medios a base de fructosa--citrato, lactosa-, o Tris-fructosa-citrato. En otro estudio de este tipo, realizado en Axis axis, se emplearon otros dos diluyentes; Triladil® y Tris-yema-citrato para la criopreservación del semen obtenido por electroeyaculación. Algunos de los diluyentes empleados para tal fin se resumen en la Tabla 1, observándose la gran variabilidad de resultados obtenidos. Por otro lado, resaltar de dicha Tabla que los dos agentes crioprotectores más empleados han sido el glicerol y la yema de huevo.

TABLA 1.  DILUYENTES UTILIZADOS PARA LA CRIOPRESERVACIÓN DEL SEMEN DE LAS DISTINTAS ESPECIES DE CÉRVIDOS.

E.Y.: electroeyaculación, V.A.: vagina artificial, pm: postmortem

NR: no reportado

(*): Sistemática de adición del glicerol=

(1): adición del glicerol en una primera y única fracción de diluyente

(2): adición del glicerol en una segunda fracción del diluyente

2. APLICACIÓN DEL MATERIAL SEMINAL

            La aplicación de las dosis seminales en las hembras se suele hacer tras la aplicación de sustancias sedantes o tranquilizantes, aunque esto se debe acompañar también de una correcta inmovilización mecánica del animal. Las vías de deposición seminal utilizadas son la vía exocervical y la intrauterina mediante laparoscopia, la cual permite la aplicación del semen directamente en el interior de los cuernos uterinos.

 Inseminación exocervical

Para realizar este tipo de IA es necesario el uso de un espéculo vaginal con fuente de luz para poder visualizar perfectamente la entrada al cuello uterino. La deposición se lleva a cabo introduciendo el cateter cargado con la dosis por la vagina a través del espéculo, tratando de introducirlo lo más profundamente posible dentro del cérvix, pero sin provocar daños en él, lo cual dificultaría posteriormente todo el proceso reproductivo. Sin embargo, debido a la barrera que supone el cérvix se suele tener que hacer la deposición de la dosis a nivel cervical superficial. No obstante, la varialibilidad de morfologías cervicales es tan amplia, que incluso se han descrito deposiciones intrauterinas vía exocervical en el ciervo rojo (Asher et al., 1993).

En el caso de la hembra de gamo, se ha conseguido la inseminación intrauterina a través  del cérvix mediante la tracción del aparato genital de la hembra hacia la vagina con el uso de unos fórceps, consiguiendo con la aplicación de semen descongelado (50 millones de espermatozoides/dosis) unas tasas de concepción del 75% (Asher et al., 1990). Sin embargo, esta técnica presenta numerosos inconvenientes que han desaconsejado su uso en la actualidad.

            Como antes señalamos, en el caso de los cérvidos la IA se realiza sobre celos y ovulaciones inducidas y/o sincronizadas. Por tanto, las inseminaciones se realizan a tiempo fijo tras finalizar el tratamiento hormonal de sincronización. Así, Fennessy et al., (1990) trabajando con ciervo rojo comprueban que aplicando semen descongelado y realizando una única IA, la fertilidad máxima que se consigue es de un 44%, cuando la deposición del material espermático se hace a las 44-52 horas de la retirada de los CIDR. En el caso de llevar a cabo una doble inseminación, a las 44 y a las 68 horas de retirar dichos dispositivos, se consigue elevar en un 14% la fertilidad respecto a cuando se realiza una única inseminación. En un amplio estudio comparativo entre el uso del semen fresco y congelado en gamo, Jabbour et al., (1993) obtienen que inseminando por vía exocervical con semen descongelado (200 millones de espermatozoides/dosis) aplicado 12 horas antes de la ovulación, se obtiene una tasa de gestación media del 62,9%, mientras que con semen fresco aplicado en ese mismo momento, no aparecen diferencias significativas entre el empleo de 12,5, 25 ó 50 millones de espermatozoides/dosis, obteniéndose en este segundo caso, una tasa de gestación media del 76,3%.

Inseminación intrauterina

            Por medio de esta técnica las hembras se inseminan directamente en el útero mediante la realización de una laparoscopia. Para ello, deben ser colocadas, previa tranquilización o sedación, sobre una camilla basculante. En general se suele llevar a cabo una anestesia corta inducida mediante la combinación de xilacina (2mg/kg de peso vivo) y ketamina (4 mg/kg de peso vivo), aplicadas en ambos casos por  vía intramuscular.

            La técnica consiste en la introducción de dos trocares (previa desinfección de la zona en la cual se va a incidir con algún desinfectante o antiséptico como el etanol o compuestos iodados), atravesando la pared abdominal, a ambos lados de la línea media del abdomen (a unos 5cm de ella y unos 10cm por delante de la glándula mamaria). Posteriormente, por uno de los orificios practicados se introduce el endoscopio y por el otro un inyector para depositar con él, la dosis seminal en la luz uterina a nivel de la curvatura mayor de los cuernos uterinos. Tras la deposición de la mitad de la dosis en uno de los cuernos se procede a localizar el otro y a depositar en él, la otra mitad de la dosis. Desde que se lleva a cabo la inducción de la anestesia hasta que se lleva a cabo su reversión, por medio de la aplicación de yohimbina endovenosa, suelen transcurrir entre 10 y 20 minutos por hembra. Esta metodología de trabajo es la más utilizada con fines productivos en Nueva Zelanda para el ciervo rojo (Asher, 1998).  Así, en esta especie se han obtenido resultados de fertilidad medios en torno al 60% trabajando con semen descongelado (Fenessy et al., 1990). Los primeros estudios realizados con gamo en los que se empleo la técnica de deposición intrauterina describen la utilización de dosis descongeladas de 85 millones de espermatozoides totales, las cuales eran depositadas en las hembras entre las 48 y las 56 horas de retirar los CIDR, obteniéndose un 42% de fertilidad al parto (Asher et al., 1988). Posteriormente, realizando la IA entre las 65 y las 70 horas de retirar los CIDR con 20-40 millones de espermatozoides/dosis congelada se han obtenido tasas de fertilidad del 68% (Fenessy et al., 1990). Más tarde, Asher et al., (1990) obtienen fertilidades del 80,8%  mediante la aplicación intrauterina de dosis seminales congeladas de 25 millones de espermatozoides aplicadas entre las 65 y las 68 horas de retirar los bloqueos progestativos. En resumen, puede referirse que los resultados medios de fertilidad para la IA intrauterina en el gamo, oscilan entre el 70 y el 80% para el semen fresco y entre el 60 y el 70% para el semen descongelado (Asher, 1998), pareciendo existir un claro efecto del genotipo sobre dichos resultados. Así, se han obtenido peores tasas de fertilidad para el gamo Mesopotámico que para el Europeo.

            Para finalizar este apartado mencionar que la reducción del estrés que puedan experimentar los animales durante la aplicación de los tratamientos de sincronización o durante la IA propiamente dicha, resulta fundamental para conseguir unos resultados de fertilidad aceptables.  Esto se debe fundamentalmente a que las situaciones estresantes pueden retrasar o inhibir la ovulación. En este sentido, en Nueva Zelanda se eliminan de los programas de IA las hembras con problemas de temperamento para intentar reducir al máximo todos los problemas anteriormente referidos.

3. RESULTADOS DEL PROGRAMA DE I.A. EN EL CIERVO IBÉRICO

En 1995 se crea el Banco de Semen de ciervo ibérico, con el objetivo de conservar a 196ºC bajo cero los gametos masculinos. Tan bajas temperaturas disminuyen el metabolismo celular, provocando un estado de inactividad total en las células espermáticas, del cual sólo se recuperan cuando son descongeladas y llevadas a temperatura ambiente. Por ello, es un sistema ideal para conservar el semen, ya que su capacidad fecundante se mantiene en el tiempo de forma ilimitada. El mayor problema está en que algunos espermatozoides mueren durante el proceso. Por ello hubo que desarrollar nuevos y mejores protocolos para esta especie. Actualmente se conservan más de 45.000 dosis seminales congeladas procedentes de unos 800 venados, algunas con casi 10 años de antigüedad. Tal vez el dato más curioso es que el semen puede obtenerse de los testículos después de la muerte de los animales. En este sentido, hemos logrado descendencia viva en ciervo ibérico después de aplicar, por medio de inseminación artificial, semen descongelado que había sido obtenido 48 horas después de la muerte del venado, teniendo esto implicaciones muy importantes de cara a la conservación del patrimonio genético de machos de interés.   

Las aplicaciones genéricas de un Banco de Semen para una especie silvestre son sobradamente conocidas, por ello a continuación describiremos únicamente los beneficios específicos que ha tenido la creación de uno para el ciervo Ibérico. Esta subespecie no está aparentemente en peligro de extinción, pero existen algunos factores que pueden amenazarla y que por tanto, justifican la creación de una reserva genética ex situ para la especie. Entre ellos destacamos los siguientes:

1º Como forma de preservar la genética autóctona ante la creciente ola de hibridaciones con otras subespecies.

2º En algunas fincas, y como consecuencia de las elevadas densidades de animales, existen importantes proporciones de animales afectados por enfermedades de relevancia en sanidad animal y para la salud pública, como la tuberculosis. Ante esta circunstancia, los bancos de semen pueden ayudar a minimizar los riesgos sanitarios de los traslados, o servir para conservar la riqueza genética ante operaciones de descaste selectivo.

3º El interés principal de la explotación de ciervos en nuestro país es el cinegético, el cual a su vez viene determinado por la calidad de los trofeos de los machos. Las técnicas desarrolladas por nuestro grupo permiten conservar el germoplasma de los mejores ejemplares, incluso después de su muerte.

La prueba definitiva que indica la eficacia de la congelación del semen, es su aplicación en hembras por medio de inseminación artificial. En el caso de los cérvidos, la inseminación artificial se realiza sobre celos y ovulaciones inducidas y/o sincronizadas mediante el empleo de tratamientos hormonales. Esta circunstancia permite realizarla a tiempo fijo tras finalizar el tratamiento de sincronización, sin necesidad de realizar detección previa de celos, lo cual en animales silvestres resultaría muy complicado o incluso imposible.

En cuanto a los resultados obtenidos mediante el empleo de esta técnica en el ciervo Ibérico, destacar que en al año 1996 efectuamos las primeras inseminaciones, que se realizaban en nuestro país en ciervos, con semen descongelado procedente de venados abatidos durante el desarrollo de la caza. Dichas inseminaciones se realizaron en la Finca LAGUNES  de Almodóvar del Campo en  Ciudad Real. De las 17 ciervas inseminadas, 4 (23,5%) quedaron gestantes y parieron a los 235±4 días. Estos resultados muestran por primera vez, la posibilidad de obtener descendencia viva en ciervo Ibérico a partir de células espermáticas criopreservadas obtenidas de animales muertos, pudiendo tener estas observaciones implicaciones de gran importancia de cara a la conservación de la calidad genética del ciervo Ibérico. Además, estos nacimientos son los primeros reportados en el Mundo, en los que se ha conseguido obtener descendencia viva en ciervos a partir de muestras seminales obtenidas de animales  que llevaban más de 24 horas muertos.

En los últimos años la eficacia de la técnica se ha incrementado notablemente, habiendo aumentado tanto el número de ciervas inseminadas, como los resultados de fertilidad de las inseminaciones realizadas con semen congelado de ciervo Ibérico. Así, hemos pasado de inseminar 25 hembras en 1995 a más de 300 en el año 1999, habiendo evolucionado los resultados de fertilidad de un 23% a, en algunos casos, más del 65% (en inseminaciones realizadas directamente en el útero), respectivamente para los años citados (Tablas 2 y 3). Esto demuestra la eficacia de nuestro Banco de Semen de ciervo Ibérico.

TABLA 2. RESULTADOS DE FERTILIDAD DE LA INSEMINACIÓN ARTIFICIAL CERVICAL EN EL CIERVO IBÉRICO.

SF: Semen fresco. SC: Semen congelado

TABLA  3. RESULTADOS DE FERTILIDAD DE LA INSEMINACIÓN INTRAUTERINA EN EL CIERVO IBÉRICO.

SF: Semen fresco. SC: Semen congelado

Además hemos podido comprobar que por medio de la inseminación artificial la transmisión de enfermedades es mínima. Los nuevos animales al nacer en la propia finca no tienen problema de adaptación alguno y por supuesto el coste de las dosis seminales no es comparable al de la compra de un macho vivo. Además, la congelación del material seminal y la inseminación, en el ciervo ibérico, tienen otra aplicación muy interesante para la mejora genética de la calidad de los trofeos de los venados, siendo éste el aspecto en el que se fundamenta gran parte de la relevancia económica de la actividad cinegética. Esta última afirmación se basa en la alta heredabilidad encontrada para las características de la cuerna en este tipo de especies, siendo por tanto un carácter fácilmente transmisible de padres a hijos.

El desarrollo de estas tecnologías reproductivas por nuestro grupo de investigación, permite hoy en día la posibilidad de obtener descendencia viva de un venado excelente, muchos años después de su muerte, mediante la conservación de su semen por medio de la congelación, tal y como ha sido descrito anteriormente. Este hecho es de gran interés por varios motivos. En primer lugar, porque permite conservar el semen de animales de gran interés desde el punto de vista cinegético y conservacionista, y eventualmente obtener descendencia suya a posteriori. Y en segundo lugar, porque desde el punto de vista de la investigación en esta materia, nos abre una gran cantidad de posibilidades, que de otra manera no se podrían realizar. En este sentido, destacamos algunas de ellas, sabiendo de antemano que existen muchas más. Así, podemos evaluar las características espermáticas de un macho con una cuerna extraordinaria y compararlas con las de otros machos con otros tipos de cuerna, incluso determinar si existe algún tipo de relación entre calidad de la cuerna y características del semen. También se puede evaluar como se comportan machos nacidos del mismo padre en ambientes muy diferentes. Y por último, puede también servir para evaluar la influencia de la genética de un animal sobre la calidad del trofeo. Seguramente, esta última aplicación puede ser de las más interesantes para la investigación en materia cinegética.

            En relación con este tipo de estudios, recientemente hemos demostrado, en colaboración con los investigadores del Museo Nacional de Ciencias Naturales (CSIC), que la cuerna de los ciervos, además de conferir ventajas a los machos a la hora de pelear con otros machos, tiene una importante función de señalización para las hembras ya que refleja la fertilidad del macho (Malo et al., 2005a,b). En concreto, hemos comprobado que cuanto más grande y más compleja es la cuerna de los ciervos machos (más ramificaciones y más puntas tiene) más fértiles son. Esta información sobre la fertilidad de los machos sería percibida por las hembras de forma que les permitiría elegir el macho con el que aparearse. Nuestro estudio recoge por primera vez que los dos factores determinantes de la fertilidad, son el número de espermatozoides producidos por un venado y la velocidad a la que estos nadan.

En resumen, acabamos de exponer los resultados más relevantes del empleo de una serie de técnicas de reproducción artificial en el ciervo ibérico. Nuestros resultados de estos 10 años demuestran que las técnicas “están a punto”, y esto posibilitará la obtención de nuevos individuos en el futuro por medio de ellas, siempre que esto se estime oportuno o de interés. Por tanto, nosotros como investigadores hemos desarrollado nuestro trabajo, ya que hemos conseguido, por encargo del propio sector, desarrollar unas tecnologías que actualmente reportan unos resultados satisfactorios. Ahora le toca decidir al propio sector cuándo está justificada su aplicación. 

            Para finalizar nos gustaría expresar nuestro agradecimiento más sincero y especial a todos aquellos propietarios, gestores y guardas de Fincas que confiaron desde un principio en nuestras ideas, y que gracias a ellos, hoy en día existen animales de nuestra subespecie, nacidos mediante elleo de estas técnicas, en nuestros campos. También, es importante para nosotros dejar muy claro que la innación artificial, a pesar de lo que algunos sugieren, no va automáticamente ligada alleo de n de venados foráneos. Nosotros, sre la sleado con n de venados autóctonos. Indudabnte, elleo de esta técnica para transmitir la genética de otras subespecies, al igual que ocurre con la monta natural, depende no de las metodologías per se, sino de la ética de cada uno, hecho que indudablemente escapa a esta conferencia. No obstante hay un dato revelador, que creo que puede ser de sumo interés para todos. Nosotros hemos podido comprobar que los machos híbridos nacidos del cruce ibérico por escocés tienen una peor calidad y cantidad de espermatozoides que los ibéricos puros. Por tanto, es muy posible, en base a lo descrito anteriormente, que su fertilidad esté muy comprometida.  

4. BIBLIOGRAFIA.