07 Mar Aplicaciones de la genética molecular en los estudios filogenéticos del caballo

Aplicación de la genética molecular en los estudios filogenéticos del caballo

 

José Luis Vega Plá

Laboratorio de Genética Molecular

Fondo de Explotación de los Servicios de Cría Caballar y Remonta

Ministerio de Defensa

 

Introducción

A finales del siglo XIX, un famoso buscador de fósiles y profesor de Paleontología de los Vertebrados, Othniel C. Marsh, encontró huesos y dientes fósiles en Wyoming y Nebrasca, los cuales organizó en serie mostrando una evolución de los ancestros del caballo hasta el actual. Esta serie arranca del Eohipus, más propiamente denominado Hyracoterium, de la época del Eoceno (unos 60 millones de años de antigüedad) hasta el Equus caballus o caballo moderno actual como hoy lo conos. Aunque la historia del género Equus está relativamente bien documentada en los registros fósiles, se plantean muchas incógnitas cuyas respuestas todavía hoy se debaten a nivel científico. Así, son un foco de discusión los largos periodos sin restos fósiles en los que se ha deducido la posible deriva evolutiva que conecta unos fósiles con los siguientes, no se explica bien la amplia diversificación que se deriva de la serie propuesta y que da lugar a estructuras morfológicas muy diferentes y, finalmente, no está clara la razón de la extinción de las supuestas y numerosas líneas evolutivas complicando enormemente la reconstrucción filogenética del caballo.

El género Equus, que incluye los caballos modernos, cebras y asnos, es el único superviviente de una gran familia que incluía 27 géneros. El momento preciso del origen del género Equus es desconocido pero hay evidencias que documentan una dispersión del mismo desde Norteamérica a Eurasia hace aproximadamente 2-3 millones de años por lo que se puede calcular un origen del género hace unos 3,4 a 3,9 millones de años. Después de lagración original, ocurrieron una serie de extinciones en Norteamérica seguidas de repoblaciones a través sre del estrecho de Bering (Kirkpatrick & Fazio 2005). La última extinción en Norteamérica ocurrió reciennte, hace aproximadamente unos 11.000 a 13.000 años. Sinargo el género Equus sobrevivió en Europa, Asia y África.

Siguiendo la clasificación que hizo Trumler en 1961 se pueden reconocer siete subespecies reciennte extintas o aún vivas: E. c. alaskae, E. c. caballus, E. c. ferus, E. c. mexicanus, E. c. mosbachensis, E. c. przewalskii y E. c. pumpelli. Estas subespecies están bien delimitadas y sus características morfológicas y distribución se han deducido de los restos fósiles, situándose en el final del Pleistoceno (2-3 millones de años) y comienzos del Cuaternario. Análisis genéticos basados en diferencias cromosómicas (Benirschke et al. 1965) y genes mitocondriales indican que la divergencia del Equus caballus empezó hace 200 a 300 mil años (George & Ryder 1986).

Estudios filogenéticos moleculares

Marcadores Moleculares

Los estudios filogenéticos a nivel molecular investigan las relaciones entre organismos usando marcadores moleculares. Éstos son regiones o secuencias del DNA que presentan características identificables que pueden diferir entre individuos. Las dos copias de un gen presentes en los dos miembros del par de cromosomas homólogos también pueden tener diferencias en su secuencia de DNA; estos dos alelos pueden o no codificar dos productos funcionalmente diferentes dependiendo de la naturaleza exacta del cambio producido en la secuencia de nucleótidos. Generalmente el objetivo de los estudios filogenéticos consiste en calcular distancias genéticas y construir árboles filogenéticos a partir de las mismas. Estos árboles deben ser consistentes (diferentes métodos analíticos obtienen el mismo árbol), eficientes (con pocos datos se debe obtener el mismo resultado que con muchos) y robustos (la posición de las ramas es estable usando un determinado método de análisis con mayor o menor número de marcadores).

El análisis de datos filogenéticos moleculares ha provocado un avance enorme en el conocimiento de las relaciones genéticas entre vertebrados. Normalmente los resultados de las investigaciones genéticas están en consonancia con las hipótesis planteadas por los estudios basados en la morfología, paleontología y geología, aunque a veces los contradicen (Zardoya & Meyer 2003). Por elo, de acuerdo con los registros fósiles y numerosos caracteres dentales y óseos, los linajes Hippidion y Equus se calcula que se separaron hace más de 10 millones de años. Algunos huesos encontrados en excavaciones en Rio Verde y Última Esperanza en la Patagonia Chilena han sido datados en finales del Pleistoceno, hace unos 2 a 3 millones de años y han sido catalogados como Hippidion saldiasi. Inesperadamente los análisis del DNA revelaron que todas las secuencias se agrupaban dentro del género Equus poniendo en duda la clasificación morfológica del Hippidion saldiasi. Se sospecha que huesos muy similares a los del Hippidion podían pertenecer a otro équido sudamericano moderno denominado Amerhippus. Esta convergencia adaptativa entre diferentes géneros pudo provocar que los paleontólogos llevaran a cabo una identificación errónea de los huesos (Orlando et al., 2003). Esta interpretación fue confirmada posteriormente por observaciones anatómicas más precisas y detalladas (Weinstock et al., 2005).

DNA antiguo

La estrategia fundamental de las investigaciones filogenéticas para entender los procesos evolutivos de las diferentes especies, consiste en diseñar estudios comparativos del DNA moderno en poblaciones actuales y la caracterización de material hereditario antiguo para detectar homologías en la secuencia genética. Sin embargo, cada vez se está tomando más conciencia de las importantes limitaciones que supone el estudio de DNA antiguo debido, en primer lugar, a su degradación en unos pocos de miles de años, también por la presencia de artefactos que pueden llevar a interpretaciones erróneas de los mismos y a la obtención de conclusiones injustificadas.

El DNA sufre a lo largo del to un proceso de degradación química que consiste en su hidrólisis y oxidación. La hidrólisis conduce a una depurinización con pérdida de bases nitrogenadas y a una fragmentación progresiva. La oxidación ocasiona una modificación de los nucleótidos con la destrucción de la estructura la base nitrogenada y del azúcar (Lindahl, 1993; Bada et al., 1999). El impacto negativo de estos factores se incnta con el to y la eratura. Una molécula hidratada de DNA se degrada y fragmenta en un periodo de unos pocos de miles de años a una eratura moderada. Un descenso de 20ºC ralentiza de 10 a 25 veces el periodo de degradación en las mismas condiciones (Höss et al., 1996). En cualquier caso se han de establecer unos controles específicos y muy rigurosos de calidad y de autentificación de las secuencias obtenidas cuando se investiga DNA antiguo.

Diseño experimental

Es muy importante hacer un diseño previo antes de abordar este tipo de investigación para evitar conclusiones especulativas y erróneas a partir de árboles filogenéticos poco creíbles. El diseño experimental se puede dividir en varias fases: muestreo, elección de los marcadores moleculares, tipificación genética, elección del modelo evolutivo y elaboración del árbol filogenético

Muestreo

La diversidad de las poblaciones investigadas debe estar representada proporcionalmente por lo que es importante realizar un muestreo adecuado de las mismas. Al menos se necesitan 25 representantes de cada población supuestamente homogénea. El muestreo debería ser aleatorio dentro de cada población, de forma que si hay un predominio de algunos reproductores éste debería verse reflejado en la muestra. Es por lo tanto incorrecto tratar de provocar un sesgo escogiendo individuos no emparentados. El número de poblaciones debería ser de al menos diez para que el árbol filogenético sea proporcionado y no se magnifiquen las relaciones entre taxones.

Marcadores genéticos

A continuación es muy importante elegir los marcadores genéticos más adecuados. La regla general es escoger marcadores con alta variabilidad para poblaciones muy relacionadas, como las razas dentro de una especie, y marcadores de regiones más conservadas para estudios entre especies (caballo, asno, cebra, etc.).

Los marcadores disponibles para los estudios filogenéticos del caballo son los polimorfismos de longitud de secuencia simple o microsatélites, el DNA mitocondrial y secuencias del cromosoma Y fundamentalmente, aunque se estudian también algunas secuencias codificantes de proteínas.

El polimorfismo de los microsatélites consiste en la existencia de un número variable de repeticiones en tándem de una secuencia básica que oscila entre uno y seis nucleótidos. Se encuentran distribuidos al azar por todo el genoma, son muy abundantes, exhiben gran polimorfismo y son fáciles de identificar.

El DNA mitocondrial tiene una estructura circular de unos 17 mil pares de bases, se encuentra dentro de las mitocondrias y por lo tanto es extracromosómico. Los análisis del DNA mitocondrial consisten en la comparación de secuencias y la detección de cambios en determinadas posiciones. Es particularmente útil para estudios evolutivos sobre DNA antiguo debido a su tamaño, abundancia y estabilidad. Una característica adicional es que se transmite por vía materna proporcionando información sobre la dispersión de linajes maternos antiguos.

Las secuencias del cromosoma Y son interesantes pues conservan información sobre linajes paternos. La combinación de estos marcadores con los de DNA mitocondrial deben proporcionar mucha información sobre la divergencia evolutiva de las poblaciones.

Tipificación

En los años 1985-86 se desarrolla una técnica para la amplificación específica de un segmento corto y concreto de DNA in vitro usando una polimerasa de DNA, desoxinucleósidos trifosfato, oligonucleótidos específicos que flanquean el segmento a amplificar y DNA molde  (Saiki et al., 1985), (Mullis et al., 1986). A esta técnica la denominaron reacción en cadena con polimerasa (PCR) y con ella se podían producir grandes cantidades de DNA específico partiendo de tan sólo una molécula de DNA en unas horas. Esta técnica ya había sido descrita anteriormente por los equipos de trabajo de Gobind Khorana (Kleppe et al., 1971), (Panet & Khorana, 1974) aunque no obtuvieron unos resultados satisfactorios.

 

A partir de la descripción original, se simplificó y mejoró el protocolo mediante el uso de una polimerasa de DNA termoestable aislada de la bacteria Termus aquaticus (Taq) (Saiki et al. 1989). Esta enzima permanece activa a eraturas superiores a 90ºC, necesarias para desnaturalizar el DNA. Parejo al desarrollo de un instrumento que proporciona ciclos de eraturas automáticamente, la Taq polimerasa reduce el trabajo necesario para llevar a cabo la reacción. Durante los últimos años esta técnica ha impulsado el análisis y conocimiento de los ácidos nucleicos, consolidándose como una herramienta poderosa en el desarrollo de técnicas de biología molecular y aplicaciones en clínica, medicina forense, etc. Los requerimientos de la reacción son simples: desoxinucleósidos trifosfatos que proporcionan energía y nucleótidos para la síntesis de la nueva cadena, polimerasa de DNA, cebadores y un tampón adecuado con sales, principalmente de magnesio. Los ciclos de calentamiento y enfriamiento (desnaturalización,  acoplamiento de los cebadores y síntesis) se repiten hasta que la reacción se desequilibra y disminuye el rendimiento o la calidad del producto sintetizado. Generalmente de 30 a 35 ciclos son suficientes para producir de 100 ng a 1 mg de DNA a partir de una copia simple de DNA molde.

La PCR es relativamente fácil de poner a punto pero tiene la desventaja de que es muy susceptible a la contaminación cruzada. Aaacute;s la Taq polimerasa introduce errores durante la amplificación que hay que tener en cuenta o emplear polimerasas alternativas en función del marcador genético elegido. Cuando el sustrato de la amplificación es DNA antiguo se pueden producir quimeras a partir del DNA incompleto y dañado, por lo que hay que tomar medidas adicionales como emplear controles positivos y negativos, clonar los productos de amplificación y secuenciarlos. Es conveniente realizar los trabajos en paralelo en laboratorios diferentes y caracterizar las secuencias del personal que potencialmente ha podido contaminar las muestras (Wayne et al., 1999).

La tipificación correcta de los marcadores moleculares es una fase crítica y la verdadera base de la investigación filogenética. Cuando se trata de tipificar secuencias de nucleótidos como en el caso del  DNA mitocondrial y cromosoma Y, los estudios comparativos se basan en alineación se secuencias. Los programas informáticos de alineamiento no distinguen entre una mutación real o un error de secuenciación por lo que hay que diseñar estrategias que minimicen los errores, como la secuenciación directa y reversa, repeticiones con variables diferentes, etc. La tipificación de alelos basados en el polimorfismo de longitud, como es el caso de los microsatélites, pasa por una identificación segura de la variante donde se emplee la misma nomenclatura dentro del mismo experimento, entre experimentos e incluso entre laboratorios. Los efectos de un alineamiento erróneo o de una tipificación incorrecta disminuyen la resolución del árbol e incluso pueden invalidar completamente la topología del árbol filogenético obtenido.

Modelo de mutación y árboles filogenéticos

Los modelos de mutación se diseñan para intentar explicar las diferencias entre las secuencias del DNA o las variantes alélicas tipificadas con el grado de divergencia entre los individuos o poblaciones. Un modelo de mutación está definido por una combinación de parámetros como las frecuencias de cada de uno de los nucleótidos o alelos, el ritmo de sustitución, la proporción de zonas invariables y la distribución de los ritmos de mutación en las diferentes zonas del genoma. Después de aplicar estos criterios se obtienen multitud de modelos. La elección del modelo más adecuado es una tarea basada en estudios estadísticos complejos. En el caso concreto de los microsatélites, el motivo repetitivo influye enornte en el modelo evolutivo, así las repeticiones sucesivas de dos nucleótidos sigue el modelo clásico de alelos infinitos, es decir, que cualquier alelo puede ocasionarse a partir de cualquier otro. Sinargo, cuando la secuencia repetitiva es de tres o más nucleótidos, un alelo condiciona la aparición del siguiente, es un modelo en escalera (Shriver et al. 1993).

La consecuencia de aplicar los algoritmos matemáticos diseñados para cada modelo, es la obtención de una matriz de datos compuesta por las distancias genéticas entre los pares de poblaciones estudiadas. Cada distancia equivale al grado de divergencia proporcional entre las dos poblaciones.

A partir de la matriz de distancias genéticas se construyen los árboles filogenéticos. Hay diferentes métodos para elaborar los árboles (neighbour-joining, UPGMA, fisch, etc.).

En la práctica, y dado el desconocimiento exacto del modelo de mutación que siguen los marcadores genéticos empleados, es recomendable tipificar poblaciones con una divergencia conocida (datos históricos, caracteres morfológicos, distribución geográfica, etc.) y aplicar varios modelos de evolución o de distancia y de construcción del árbol filogenético. Aquel que se ajuste mejor en las poblaciones de referencia puede ser el adecuado y el que responda mejor a las hipótesis planteadas.

La credibilidad de los resultados se basa en los límites de confianza de las relaciones filogenéticas obtenidos mediante técnicas de estreo (Felsenstein, 1985), métodos iterativos de Markov y de Monte Carlo comolea Li et al. (2000), aplicación de algoritmos bayesianos o de genética de metapoblaciones (Lemmon & Milinkovitch 2002). Alternativamente pueden ser obtenidas representaciones de las relaciones genéticas usando procedimientos de análisis multivariante (Moazami-Goudarzi & Laloe 2002).

Estudios filogenéticas del caballo

Marcadores genéticos

Vilà et al. (2001) analizaron la región de control del DNA mitocondrial en 191 caballos de 10 razas encontrando gran diversidad en las líneas maternas. Los análisis de muestras de équidos procedentes de nichos arqueológicos, incluso de finales del Pleistoceno mostraron que la elevada diversidad del DNA mitocondrial no se debe a un ritmo de mutación acelerado sino a que estas secuencias ya se hallaban presentes antes de la domesticación y de la aparición de las razas tal y como hoy las entens. Mirol et al. (2002) analizaron una parte de la región de control del DNA mitocondrial de 104 caballos de nueve razas sudamericanas y españolas. Aunque el resultado de la alta variabilidad de secuencias encontradas podría interpretarse como una mezcla de los ancestros de estas razas, todo parece indicar que ha habido una conservación de secuencias maternas muy antiguas. Keyser-Tracqui et al. (2005) analizaron esta misma región del DNA mitocondrial en restos de una tumba congelada de hace 2.300 años, llegando también a la misma conclusión, la variabilidad genética procede de la mezcla de líneas maternas muy antiguas. Estos resultados indican claramente que abordar estudios de relaciones filogenéticas entre razas de caballos basados en el análisis de DNA mitocondrial puede conducir a errores de interpretación. Por elo Kim et al. (1999) llegaron a la conclusión que el caballo Cheju tenía un origen en la mezcla de diversas razas por línea materna. Con los datos de los que se dispone hoy en día esta variabilidad materna se puede considerar como normal y no refleja el origen racial de estos caballos.

Sinargo el alto grado de variabilidad del DNA mitocondrial no se corresponde con los resultados esperados en el análisis de las líneas paternas a partir de las secuencias del cromosoma Y. De hecho en un estudio realizado secuenciando regiones no codificantes con un total 14,3 kilobases del cromosoma Y en 52 ntales de 15 razas, no se identificó ningún punto de segregación (Lindaren et al. 2004). Si se encontraron divergencias con muestras de Equus caballus przewalsqui y con Equus asinus. Una primera interpretación, a la espera de estudios más exhaustivos, podría ser que el foco de domesticación pudo ser único y los sementales se iban cruzando con las hembras salvajes a medida que el caballo doméstico se dispersaba. La poca varibilidad encontrada en el cromosoma Y indica que no es un marcador adecuado para el estudio de la relaciones filogenéticas entre las razas de caballos.

Los microsatellites, a diferencia de los marcadores genéticos citados, han demostrado ser los más informativos para dilucidar las relaciones genéticas entre poblaciones de animales tanto salvajes como domésticos incluidos los caballos (e.g. Moazami-Goudarzi et al., 1997; McHugh et al., 1998; Martínez et al., 2000; Cañon et al., 2000; Kelly et al., 2002; Tozaki et al. 2003). Los microsatélites permiten conocer la estructura genética de las poblaciones e incluso asignar individuos a su población de origen (Bjornstad et al., 2002). Esto es particularmente interesante cuando se conocen o sospechan mezclas en las poblaciones estudiadas, debido a que este fenómeno contradice los principios de fiabilidad de los árboles obtenidos.

En un estudio reciente se investiga la originalidad de una raza equina, denominada Caballo de las Retuertas, que se cría en la Reserva Bilógica de Doñana desde hace tres décadas (Vega-Pla et al. 2005). Este caballo procede de una selección de unos pocos animales rústicos, sobrios y adaptados a las difíciles condiciones de la Marisma. Se hace un muestreo que incluye la casi totalidad de la población actual (55 muestras). Se escogen razas equinas para detectar parecido genético con el actual Caballo de Marismeño (26), el Pura Raza Española (60), y otras razas de referencia con relaciones filogenéticas conocidas: caballos de origen celta como el Asturcón (39) Potoka (27) y Losino (58); caballos de la Islas Baleares como el Mallorquín (30) y el Menorquín (69); alguna raza iberoamericana como un caballo cubano (24) y tres razas brasileñas como el Pantaneiro (45), Marajoara (60) y Mangalarga (43); dos razas de difusión internacional como el Pura Sangre Inglés (46) y el Árabe (44); finalmente se introduce una población de asnos (44) con el fin darle una orientación al árbol filogenético.

Los marcadores escogidos fueron los microsatélites, una batería de 21 marcadores que amplificaron en las dos especies consideradas. Se aplicaron varios algoritmos de distancia y se construyeron los correspondientes árboles filogenéticos. Las razas de referencia fueron esenciales para elegir el modelo de distancia y el método de construcción del árbol. Los resultados mostraron que las poblaciones se distribuían de la forma esperada y que el Caballo de las Retuertas es realmente original y que no se parece a ninguna de las razas estudiadas.

En conclusión, la utilidad de los análisis moleculares en los estudios filogenéticos del caballo es indiscutible aunque necesita un debate más amplio para su uso e interpretación correctos. De todas formas es indispensable establecer a priori las hipótesis filogenéticas basadas en los registros paleontológicos e históricos y otros de índole morfológica, genética, social y geográfica para que la biología molecular desarrolle todo el potencial que se espera de esta poderosa disciplina.

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