Todas las razones anteriormente enumeradas justifican el empleo de la Biotecnología de la Reproducción como herramienta útil para contribuir a la gestión de las poblaciones naturales de ciervo, como es el caso del ciervo ibérico. De todas las técnicas de Reproducción Asistida existentes, la más ampliamente difundida en todas las especies animales ha sido la Inseminación Artificial. El desarrollo de un programa de IA en condiciones óptimas para el ciervo ibérico, igual que para cualquier otra especie, necesitó del abordaje de tres líneas de investigación:

–        Conocimiento de la fisiología reproductiva de la subespecie

–        Desarrollo de sistemas de control y sincronización de celos

–        Desarrollo de una metodología satisfactoria de obtención-conservación del semen y aplicación de las técnicas de IA propiamente dichas.

En este discurso, presentaremos el estado actual de dichas tecnologías reproductivas aplicadas a poblaciones naturales de ciervo, dedicando especial atención a aspectos relacionados con la inducción y sincronización de celos, los métodos de obtención del semen, la crioconservación espermática, y la inseminación artificial. Además, los hallazgos encontrados durante el estudio de los parámetros reproductivos de las poblaciones naturales de ciervo, han tenido una enorme importancia para la identificación de mecanismos reproductivos básicos que no habían sido identificados en especies ganaderas o en la especie humana. Estos resultados serán brevemente comentados al final de este discurso.  

SINCRONIZACIÓN DE CELOS Y OVULACIONES

En una primera fase de nuestro estudio, nos propusimos como objetivo el determinar los patrones reproductivos básicos de las hembras de ciervo ibérico. Así, demostramos que presentan un patrón estacional de reproducción (García et al. 2002), teniendo un ciclo sexual, cuya duración oscila de 19 a 20 días (García et al. 2003a). Esta subespecie de ciervo común presenta su temporada reproductiva, en la que tiene varios ciclos estrales, durante los días de fotoperiodo decreciente (García et al. 2002). Además, mediante determinación de los niveles plasmáticos de melatonina en sangre, observamos también que la subespecie presenta un perfil estacional de secreción de la misma (García et al. 2003b), y que en todas las estaciones los niveles son muy superiores durante la noche que durante el día. Por tanto, podemos definir a la hembra de ciervo ibérico como una subespecie poliéstrica estacional de días cortos  (García et al. 2002).   

La inducción y la sincronización de celos y ovulaciones son por sí mismas tecnologías reproductivas que permiten importantes mejoras zootécnicas, pero cuyo concurso se plantea como necesario para el desarrollo de la técnica de inseminación artificial a nivel práctico para su uso en grandes colectivos de animales (Pérez-García 1989). De este modo, previamente al planteamiento de un programa de inseminación artificial propiamente dicho, hay que controlar perfectamente la actividad ovárica en las hembras; ya que en caso contrario, el programa resultaría económicamente poco viable al pretender llevarlo a cabo en hembras inseminadas sobre celo natural. Esta problemática es aún mayor en las especies silvestres por la dificultad que entraña la detección del comportamiento de estro en este tipo de animales. Esta dificultad de detección del celo se ve agravada por el medio físico de la explotación y por las características etológicas de estas especies. Por todo ello, resulta interesante contar con métodos fiables y conocidos para controlar el ciclo ovárico de las ciervas, de modo que se pueda llevar a cabo la inseminación a tiempo fijo tras el empleo de tratamientos hormonales. En la mayoría de las especies de ciervo, tienen lugar ovulaciones recurrentes como una lógica consecuencia de un fracaso en la fecundación en el ciclo anterior (García et al. 2003a). La secreción de progesterona debida al cuerpo lúteo es interrumpida por la acción de la prostaglandina F2α secretada por el útero no gestante.   

El control del ciclo sexual se ha realizado empíricamente desde la más remota antigüedad mediante el denominado “efecto macho”. Éste consistía en introducir machos en un rebaño de hembras, durante una estación determinada del año, lográndose que se sincronizaran los celos y por lo tanto, las ovulaciones entre las hembras del grupo. Este método tradicional de sincronización ha sido también empleado en los ciervos (Asher et al. 1993). Sin embargo, este sistema no proporciona un grado de sincronización lo suficientemente adecuado como para poder realizar la inseminación con garantías de éxito, recurriéndose por ello, al empleo de tratamientos hormonales de sincronización e inducción de celos y ovulaciones. Los productos hormonales más utilizados para la sincronización de los ciclos sexuales en las ciervas han sido la progesterona y la prostaglandina F2α (Asher et al. 1993). Numerosos estudios previos realizados con ciervos de granja, han demostrado la utilidad del empleo de progesterona o de sus derivados, por medio de dispositivos intravaginales, para el eficaz control de los ciclos sexuales en las ciervas (Asher et al. 1993). Resultados muy similares fueron reportados para el ganado ovino con anterioridad (Pérez García 1989). Además, la administración de gonadotropina coriónica equina (eCG) al final del tratamiento con progesterona se usa de forma generalizada en estas especies (Asher et al. 1993). La eficacia de este tratamiento (progesterona + eCG), como método para la sincronización de los ciclos estrales de las ciervas ibéricas fue evaluada por nuestro grupo, observando que por medio del mismo se obtenía un grado de sincronización de celos y ovulaciones muy próximo al 75%  (García et al. 1998). Así, hemos adoptado la combinación de estas dos hormonas como método de elección para la sincronización de los ciclos sexuales de las ciervas previamente a la aplicación de la inseminación artificial (Soler et al. 2003b; Malo et al. 2005a), habiendo obtenido resultados de fertilidad muy aceptables, como posteriormente veremos.

El empleo de inyecciones de prostaglandina F2α para la sincronización de los ciclos sexuales de las ciervas, ha sido también referido, aunque los resultados de sincronización obtenidos han sido generalmente inferiores y más irregulares a los reflejados por el uso de progesterona (Asher et al. 1993).

OBTENCIÓN DEL MATERIAL ESPERMÁTICO

La recogida del material seminal en el ciervo es uno de los aspectos más problemáticos para el desarrollo de las distintas biotecnologías reproductivas, por lo que ha sido el factor limitante para la implantación más extensa de estas biotecnologías reproductivas en los ciervos criados en cautividad. Primeramente, existen grandes variaciones debidas a la estación (Asher et al. 1993), tanto en la calidad como en la cantidad del semen, que hacen que éste sólo pueda ser obtenido durante unas épocas muy concretas del año, existiendo un periodo muy pronunciado de quiescencia testicular durante la primavera y el verano, en el cual los machos son completamente infértiles (Asher 1998). Esto limita el periodo de obtención seminal a 4-6 meses por año. En segundo lugar, la obtención del semen se ve dificultada enormemente por el temperamento que presentan estos animales. Este último hecho ha originado que los métodos para la obtención seminal ideados para otras especies no hayan tenido el mismo desarrollo en los ciervos.

La obtención de muestras seminales eyaculadas de ciervo se ha llevado a cabo mediante métodos como la vagina artificial (Gizejewski 2000) y la electroeyaculación (Asher et al. 1993). La vagina artificial, aunque ha sido utilizada en otras subespecies de ciervo (Gizejewski 2000), presenta riesgos debido al temperamento de los animales. Por otro lado, la electroeyaculación, aunque ya ha sido empleada para especies silvestres (Fennessy et al. 1990; Asher et al. 1993; Comizzoli et al. 2001, Garde et al. 2003) puede dar lugar a una peor calidad seminal, a una menor resistencia a la crioconservación y a lesiones en los sementales (Asher et al. 1993). Estos riesgos se acentúan por tratarse de animales silvestres, pudiéndose provocar la muerte del animal por las manipulaciones previas a la propia obtención del semen, como la anestesia o la captura (Asher et al. 1993).

Estos inconvenientes pueden evitarse con la obtención de muestras espermáticas a partir de los epidídimos de animales muertos (Foote 2000). Esta posibilidad ha provocado un aumento en el interés por la obtención y crioconservación del germoplasma de especies silvestres (Foote 2000), permitiendo la obtención de muestras espermáticas de diversas especies de ciervos (Zomborszky et al. 1999; Comizzoli et al. 2001), y concretamente del ciervo ibérico (Soler et al. 2003b; Martínez-Pastor et al. 2005a; 2006a). Aaacute;s, el aprovechamiento cinegético de muchas de estas especies favorece la recogida postmortem de las muestras espermáticas epididimarias a partir de los machos abatidos durante el transcurso de las distintas modalidades cinegéticas (Zomborszky et al. 1999; Soler et al. 2003b). Por todo ello, en las condiciones anteriormente descritas, el sis más factible, por lo menos a priori, para la obtención de n de ciervos selectos para su crioconservación, es la recogida postmortem en aquellos machos abatidos durante el transcurso de las distintas modalidades cinegéticas. Esta metodología nos permite además, conservar el germoplasma de los mejores ciervos en cuanto a la calidad de sus cuernas (Garde et al. 2006). 

         No obstante, elleo de muestras espermáticas epididimarias obtenidas postmortem, nos planteó inicialmente una serie de dudas biológicas que a lo largo de estos últimos diez años hemos intentado resolver. En primer lugar, que la reducida viabilidad inicial de las muestras así obtenidas pudiese impedir la generación de nuevos individuos por medio de la aplicación de estas tecnologías, ya que en ocasiones las muestras son extraídas del animal a las 24 horas de la muerte. Además, al ser muestras obtenidas del epidídimo, las mismas van a presentar un porcentaje elevado de formas espermáticas inmaduras, que podría influir en la fertilidad de la muestra o incluso en su resistencia a la congelación. Y en tercer lugar, los espermatozoides procedentes de estos machos no son eyaculados, con lo cual no han contactado con ciertos elementos protectores del plasma seminal, que facilitan la resistencia de la célula espermática a los procesos de congelación, por lo que su resistencia a este proceso podría verse disminuida (Martínez-Pastor et al. 2006b). Para resolver estas dudas desarrollamos una serie de trabajos, cuyos resultados más relevantes me permito comentarles a continuación. Algunos de estos hallazgos se referirán posteriormente, al relatar los resultados obtenidos en el campo de la crioconservación espermática.

En relación con la evaluación del efecto del tiempo transcurrido desde la muerte de los machos a la obtención de los testículos, sobre la calidad espermática y la capacidad fecundante de las muestras, obtuvimos los resultados que se detallan a continuación. El tiempo transcurrido desde la muerte del animal hasta la obtención de las muestras espermáticas influyó negativamente sobre la calidad espermática y sobre la capacidad fecundante de las muestras obtenidas del epidídimo de ciervos muertos (Garde et al. 1998; Soler y Garde 2003, Martínez-Pastor et al. 2005a; 2005c). Así, los valores de calidad seminal obtenidos a partir de las 12 horas de la muerte de los animales fueron significativamente inferiores para los distintos parámetros evaluados (movilidad, viabilidad, integridad morfológica y capacidad fecundante). Por tanto, estos primeros resultados vinieron a demostrar que la calidad espermática disminuye de forma rápida después de la muerte de los machos (Soler y Garde 2003).

Para intentar resolver la problemática anteriormente planteada, realizamos una serie de pruebas en las que evaluamos el efecto sobre la calidad espermática de la conservación a 5ºC, durante intervalos de tiempo prolongados, de los testículos después de la muerte de los animales (Soler et al. 2003c). Los resultados de estos trabajos demostraron que la viabilidad espermática se mantenía sin ningún tipo de alteración hasta 4 días después de la muerte de los machos, cuando los testículos habían sido previamente conservados a 5ºC (Soler et al. 2003c). Estos resultados, tienen una connotación práctica muy importante, ya que indican que las muestras espermáticas que no puedan ser procesadas rápidamente para su congelación, por ausencia de medios, pueden ser almacenas o incluso transportadas en frío hasta un laboratorio donde existan los medios humanos o materiales que posibiliten la congelación seminal con garantías de éxito. 

Otro aspecto de interés desde el punto de vista de la investigación, relacionado con el empleo de espermatozoides epididimarios, reside en el hecho de que los mismos nunca han contactado con el plasma seminal, el cual les confiere algunos elementos que contribuyen a incrementar la viabilidad espermática (Chen et al. 2002). Recientemente se ha demostrado que los daños celulares sobre el ADN espermático debidos al estrés oxidativo son mucho más intensos en espermatozoides no expuestos nunca al plasma seminal (Chen et al. 2003) o separados del mismo antes del proceso de congelación (Donnelly et al. 2001), indicando estos resultados que los distintos componentes del plasma seminal podrían desempeñar un papel importante en la conservación de la integridad del genoma espermático (Chen et al. 2002). En la especie humana (Zini et al. 2002) y bovina (Bilodeau et al. 2000) se ha reportado que el plasma seminal contiene enzimas antioxidantes como la superoxido dismutasa, la catalasa y la glutation peroxidasa, además de quelantes de radicales libres. Similares hallazgos se han descrito en roedores (Chen et al. 2003). Por ello, evaluamos el efecto de la adición de algunas de estas sustancias sobre la calidad espermática de las muestras de ciervo obtenidas del epidídimo. Así, en primer lugar pudimos determinar que la adición de plasma seminal homólogo a este tipo de muestras incrementaba la calidad y viabilidad de las mismas (Martínez-Pastor et al. 2005a). Posteriormente, hemos podido observar que la adición de superoxido dismutasa, catalasa, y Vitamina C a los medios de incubación espermática prolonga en el tiempo la vida útil de los espermatozoides epididimarios de ciervo (Fernández-Santos et al. 2007a). Por tanto, todos estos resultados demuestran el papel protector que los agentes antioxidantes proporcionan a las muestras espermáticas epididimarias. Este efecto beneficioso se observa tanto en la características espermáticas básicas (movilidad, viabilidad, integridad morfológica), como en la integridad del ADN espermático (Fernández-Santos et al. 2007a).     

    En los animales no acostumbrados al manejo humano es necesario recurrir a la obtención de semen mediante técnicas de electroeyaculación bajo anestesia quirúrgica. El empleo de esta técnica ha planteado siempre mucha controversia. En nuestra experiencia con ungulados no se ha encontrado inconveniente alguno por la aplicación de la misma y se ha utilizado en forma reiterada sobre los mismos machos sin consecuencias negativas (Garde et al. 2003, Soler et al. 2003a; Martínez-Pastor et al. 2006b, 2006c), lo cual es importante, ya que en ocasiones interesa realizar recolecciones repetidas de cada macho con el fin de conservar un elevado número de muestras para su utilización futura.

Por último, es importante señalar que un aspecto de gran relevancia dentro de la Andrología moderna es el delleo de técnicas de laboratorio capaces de determinar con éxito la calidad y la capacidad fecundante de las distintas muestras espermáticas. En este sentido, s desarrollado y adaptado numerosas pruebas para la evaluación eficaz de las distintas funciones de los espermatozoides frescos y descongelados de ciervo. Así, aaacute;s delleo de las técnicas rutinarias de evaluación nal (Garde et al. 1998; Soler et al. 2003a), s incorporado a nuestros estudios otras herramientas de análisis nal como: la evaluación de distintos parámetros de movilidad por medio de siss de análisis de imagen (Malo et al. 2005a; 2005b; Martínez-Pastor et al. 2005b, 2005c; 2006b; 2006c), la evaluación de la integridad del ADN, del estado de la mitocondria, y de la fluidez de ranas espermáticas por medio de nuevas técnicas de citometría de flujo (García-Macías et al. 2006; Fernández-Santos et al. 2007a),  la determinación de la capacidad fecundante in vitro por medio de pruebas de fecundación in vitro  (Soler y Garde 2003), y la determinación de las dimensiones de las cabezas de los espermatozoides por medio de  sistemas computerizados de análisis de imagen (Esteso et al. 2003; 2006, Soler et al. 2005b). El empleo de todas estas nuevas tecnologías de análisis espermático nos ha permitido obtener una información mucho más completa acerca de la fisiología de los espermatozoides de ésta y de otras especies.   

CRIOCONSERVACIÓN  ESPERMÁTICA

La congelación del material espermático presenta un gran número de ventajas. Entre ellas, destacamos las siguientes: preservación y uso de germoplasma sin limitaciones en el tiempo y en el espacio, prevención de riesgos sanitarios al poder transportar germoplasma congelado en lugar de trasladar animales vivos, y mejor manejo del espacio, ya que permite la conservación indefinida del material genético  sin necesidad de ocupar grandes espacios en los programas de cría (Watson y Holt 2001). Además, permite el intercambio de material genético entre individuos que estén muy alejados geográficamente, siendo este hecho de especial interés de cara a disminuir la consanguinidad en poblaciones fragmentadas de especies en peligro de extinción (Watson y Holt 2001). La crioconservación del material seminal es uno de los aspectos fundamentales en el manejo de los bancos de germoplasma. Además, es uno de los aspectos más críticos ya que los espermatozoides están sometidos, tanto durante el proceso de congelación como el de descongelación, a numerosas situaciones de estrés (Watson 1995). 

La congelación del semen de ciervo, al igual que la de otros rumiantes, resulta más compleja que la de otras especies animales, debido fundamentalmente a las características bioquímicas y morfológicas de los espermatozoides de estos animales (Graham et al. 1978). Además, el empleo de la crioconservación del material seminal y su uso mediante inseminación artificial ha sido desarrollado en la mayoría de las especies domésticas (Holt 2001), no presentando, sin embargo, el mismo progreso en las especies silvestres (Garde et al. 2003). No obstante, la congelación del material espermático en las distintas especies de ciervos se viene realizando desde hace bastantes años (Asher et al. 2000).  

          A pesar de ello, la mayoría de los protocolos utilizados para la congelación de las muestras espermáticas epididimarias se basan en los desarrollados para semen eyaculado (Graham et al. 1978; Krzywinski 1981; Asher et al. 2000), no habiendo protocolos específicos para las muestras procedentes del epidídimo. Este procedimiento no parece muy apropiado, debido a las diferencias fisiológicas existentes entre el semen eyaculado y las muestras espermáticas epididimarias. Estas diferencias se deben principalmente a que los espermatozoides epididimarios no han estado expuestos a las secreciones de las glándulas sexuales accesorias (plasma seminal); estas secreciones modulan la sensibilidad al enfriamiento, así como la resistencia a la congelación (Yu et al. 2002). Además, el plasma seminal contiene enzimas antioxidantes (Bilodeau et al. 2000; Zini et al. 2002) que confieren protección frente al estrés oxidativo, pudiendo desempeñar un papel importante en la defensa frente a la producción de radicales libres de oxígeno que tiene lugar durante la congelación espermática. Igualmente, hemos puesto de manifiesto mediante la realización de varios trabajos la existencia de importantes diferencias de osmolaridad  entre las muestras procedentes del epidídimo y las eyaculadas en el ciervo ibérico (Martínez-Pastor et al. 2006b; Fernández-Santos et al. 2007b), hecho que indudablemente va a afectar de forma diferente a la resistencia a la congelación de los dos tipos de muestras espermáticas (Martínez-Pastor et al. 2006b).

          Por otro lado, también se ha puesto de manifiesto la existencia en distintas especies, de diferencias en la resistencia a la congelación entre espermatozoides eyaculados y aquellos que tienen su origen en el epidídimo (Martínez-Pastor et al. 2006b). Es indudable, por tanto, que el origen anatómico de las muestras debe ser muy tenido en cuenta para mejorar los protocolos de congelación de los espermatozoides de las distintas especies.

El daño que experimentan los espermatozoides durante la crioconservación ha sido atribuido a diversos factores, entre los que destacamos los siguientes: cambios en la temperatura, formación de cristales de hielo, estrés oxidativo, alteraciones en las membranas espermáticas, daño en el ADN, toxicidad a los crioprotectores y estrés osmótico (Watson 1995). Estos daños pueden verse disminuidos si elegimos el diluyente de congelación adecuado. Sin embargo, para especies silvestres se han usado diluyentes adaptados a partir de otros de especies domésticas, con pocas o ninguna modificación (Garde et al. 2003). Teniendo en cuenta las diferencias y problemas anteriormente expuestos, sería preferible y deseable optimizar los protocolos para poder contar con diluyentes específicos disponibles no sólo para cada especie, sino también para cada tipo de muestra, dependiendo de su origen.

El protocolo para la congelación de dichas muestras utilizado de forma tradicional era prácticamente el mismo que se venía utilizando para las muestras seminales procedentes de eyaculados de animales domésticos. Así, en un protocolo típico para eyaculados de ciervo, las muestras seminales se diluían en un medio (Tris-citrato-fructosa con un 20% de yema de huevo) de 320 mOsm/kg, con una concentración final de glicerol de un 3%. Posteriormente, las mismas se enfriaban lentamente hasta una temperatura de 5ºC, permaneciendo 2 horas más a esta temperatura para su equilibrado. Transcurrido este tiempo las dosis espermáticas eran congeladas en vapores de nitrógeno líquido y almacenadas a –196ºC hasta su empleo (Asher et al. 2000). 

Por lo tanto, el objetivo general de nuestra línea de investigación, dentro de este apartado, se orientó hacia la adaptación de estos protocolos para su uso con muestras espermáticas epididimarias de ciervo, con el objeto de mejorar la eficacia de los mismos para este tipo de muestras. Los resultados de investigación obtenidos durante estos últimos años nos han permitido proponer una serie de mejoras en la técnica de crioconservación de las muestras espermáticas epididimarias de ciervo. De entre todos estos resultados, me permito destacar a continuación los que creo que han sido más relevantes para el progreso de esta línea de investigación.

Los efectos del enfriamiento sobre la calidad de las muestras espermáticas se han estudiado en múltiples trabajos. Durante el enfriamiento, el “choque frío” produce, en los espermatozoides de la mayoría de las especies, una reducción en la motilidad y en el metabolismo de los carbohidratos (Watson 1995). Además, produce liberación de enzimas y lípidos intracelulares, redistribución de iones y cambios morfológicos, sobre todo en el acrosoma (Watson 1995). Los efectos nocivos producidos durante la refrigeración pueden evitarse modificando la velocidad de enfriamiento y/o añadiendo yema de huevo al diluyente de congelación (Watson 1995, Holt 2001).

Por todo ello, en primer lugar, estudiamos el efecto combinado de dos variables sobre la supervivencia de los espermatozoides epididimarios al proceso de congelación. Con este objetivo, se diseñó un experimento para determinar qué concentración y qué método de preparación de la de huevo ( centrifugada —clarificada— vs. completa) eran los más adecuados para la congelación de los espermatozoides epididimarios de ciervo. A la descongelación, independiennte de la concentración de , la clarificada reportó los mejores resultados, y la concentración más apropiada fue la de un 20%. Los resultados obtenidos nos llevaron a diseñar un nuevo experimento, con el fin de comprobar de forma conjunta los efectos de tres variables sobre la congelabilidad de las muestras espermáticas epididimarias de ciervo: concentración de clarificada (0, 5, 10 y 20%), concentración final de glicerol (3 y 6%) y velocidad de enfriamiento desde 22ºC a 5ºC (lenta vs. rápida). Tras la evaluación de los resultados, observamos que el diluyente de congelación con un 20% de yema de huevo clarificada y una concentración final de glicerol del 6%, junto con la aplicación de una velocidad de enfriamiento rápida, mejoraron significativamente la resistencia a la congelación de los espermatozoides epididimarios de esta especie (Fernández-Santos et al. 2006a; 2006b).

El tipo y la concentración del crioprotector pueden afectar al resultado final del proceso de congelación espermática (Watson y Holt 2001). La acción del crioprotector depende de su coeficiente de permeabilidad, siendo el crioprotector más adecuado, aquel que pueda pasar a través de la membrana celular y equilibrar su concentración en menos tiempo (Gilmore et al. 1997), evitando situaciones de estrés debidas a los cambios de volumen del citoplasma. Sin embargo, esta permeabilidad es diferente dependiendo de la especie, debido a las diferencias en la composición de las membranas espermáticas (Gilmore et al. 1997). Así, el dimetil sulfóxido (DMSO) tiene una permeabilidad menor que el glicerol para los espermatozoides de hombre, mientras que la misma es similar para los espermatozoides de perro (Thirumala et al. 2003).

Algunos de los crioprotectores permeables a la membrana más utilizados en los protocolos de congelación han sido el etilenglicol, el propilenglicol, el DMSO y el glicerol (Holt 2001). De todos ellos, el glicerol ha sido el más efectivo para la congelación del semen de rumiantes (Leibo y Songsasen 2002), oscilando su concentración óptima en los diluyentes entre el 4% y el 8% (Holt 2001; Leibo y Songsasen 2002).

Concretamente, el glicerol es el crioprotector que siempre se ha utilizado para congelar espermatozoides epididimarios de ciervo (Zomborszky et al. 1999; Asher et al. 2000; Soler et al. 2005a), siguiendo los protocolos utilizados para congelar semen eyaculado (Asher et al. 2000). Sin embargo, se ha demostrado que los espermatozoides tienen diferente respuesta a los crioprotectores permeables dependiendo de su origen anatómico (Martínez-Pastor et al. 2006b).

Por ello, otro de nuestros objetivos fue el de comprobar la efectividad de un crioprotector clásico, el glicerol, comparado con otros crioprotectores permeables, sobre la resistencia a la congelación de las muestras espermáticas epididimarias de ciervo. Para ello, evaluamos los efectos de tres crioprotectores (glicerol, etilenglicol y propilenglicol), así como de tres concentraciones de cada uno (3, 6 y 12%). Los resultados mostraron que un 6% de glicerol era la opción más favorable para la congelación de las muestras espermáticas epididimarias de esta especie (Fernández-Santos et al. 2006c).

La temperatura de adición del crioprotector es otro aspecto importante a tener en cuenta en el desarrollo de los protocolos de congelación espermática, ya que la movilidad de los espermatozoides a la descongelación en diversas especies puede verse afectada en función de la misma (Watson 1995; Holt 2001). En la mayoría de los protocolos de congelación, el glicerol se añade a 5ºC (Graham et al. 1978; Fiser y Fairfull 1990). Nosotros evaluamos el efecto de la temperatura de adición del glicerol (22°C ó 5°C) sobre la  resistencia a la congelación de este tipo de espermatozoides. Los resultados de nuestro estudio indicaron que, como alternativa al protocolo comúnmente utilizado para la congelación de semen de ciervo (3–4% glicerol añadido a 5ºC), la congelación de las muestras espermáticas epididimarias debe realizarse con un diluyente con un 6% de glicerol añadido a temperatura ambiente (Fernández-Santos et al. 2006c). Este resultado es muy favorable desde un punto de vista aplicado ya que simplifica la fase de refrigeración en el protocolo de crioconservación. Este hecho tiene especial relevancia cuando se trabaja en condiciones de campo, evitando la necesidad de manipular las muestras en refrigeración para añadir el crioprotector.

Siguiendo con nuestro objetivo de optimizar el protocolo de congelación para las muestras espermáticas epididimarias de ciervo, llevamos a cabo otros dos experimentos. El primero, diseñado para la determinación de la osmolaridad (300–600 mOsm/kg) más idónea del diluyente (Tris-citrato-fructosa); y el segundo, para el estudio  de los efectos de la adición de diferentes azúcares al diluyente (glucosa, fructosa, manosa, sacarosa, maltosa, trehalosa y rafinosa) sobre la resistencia de las muestras a la congelación. Nuestros resultados mostraron que el uso de diluyentes de congelación con osmolaridades superiores a 425 mOsm/kg conlleva efectos deletéreos para los espermatozoides, siendo la osmolaridad de 400 mOsm/kg la más apropiada para el mantenimiento de la motilidad tras la crioconservación de estos espermatozoides (Fernández-Santos et al. 2007b). En cuanto al segundo experimento, el azúcar más adecuado para añadir al diluyente de congelación para las muestras espermáticas epididimarias de esta especie, fue la fructosa.

Además, y teniendo en cuenta que el estrés oxidativo es el responsable, en parte, de la muerte y de la pérdida de funcionalidad de los espermatozoides durante la congelación (Watson 1995), diseñamos un último estudio orientado a evitar estas alteraciones. El principal objetivo de este trabajo fue el de determinar el posible efecto protector de diferentes antioxidantes durante la crioconservación de los espermatozoides epididimarios de ciervo. Para ello, se llevaron a cabo dos experimentos: en el primero se evaluó el efecto de dos antioxidantes enzimáticos (catalasa y superóxido dismutasa) y en el segundo, de varios antioxidantes no enzimáticos (vitamina E, vitamina C y BHT) sobre la resistencia de los espermatozoides al proceso de congelación. Este estudio demostró que la adición de antioxidantes enzimáticos al medio de congelación mejoraba la mayoría de los parámetros espermáticos tras la descongela