Descripcion

Alteraciones de los componentes de

la leche por tratamientos térmicos

 

Dr. D. Salvio Jiménez Pérez

25 de octubre de 1995

 

 

 

Excmo. Sr. Presidente

Excmos e Ilmos. Sres. Académicos

Señoras y señores

 

            Quiero que mis primeras palabras sean de reconocimiento, admiración y gratitud, a la Real Academia de Ciencias Veterinarias y a los Ilustres Académicos que con su benevolencia y consideración me han proporcionado la inmensa satisfacción y honor, de acogerme hoy en su seno como miembro numerario de la misma.

 

            Quiero agradecer al Excmo. e Ilmo. Sr. Presidente, Profesor Dr. D. Mariano Illera Martín, de cuya persona y cargo, vengo a recibir estos honores, y expresarle mi deseo de colaboración tanto institucional como personal.

 

            Gratitud especial para los promotores e impulsores de mi ingreso. A mi Profesor y Amigo Dr. D. Rafael Jurado Couto, que me honra al aceptar el compromiso de contestar al Discurso de Ingreso y a mi Compañero y Amigo Dr. D. José Alberto Rodríguez Zazo al que después de muchos años de andar por caminos profesionales distintos nos hemos vuelto a encontrar en esta casa.

 

            Agradecimiento a quienes avalaron mi solicitud. Al Profesor Dr. D. Emilio Ballesteros Moreno, que tuve la suerte de conocer en la Cátedra del Profesor D. Félix Sánz Sánchez y la fortuna de ser su amigo. Al Profesor de Investigación Dr. D. Carlos Barros Santos, antiguo compañero del Consejo Superior de Investigaciones Científicas cuyo paso por el Instituto de Normalización, dejo una profunda huella en todos nosotros.

 

            El agradecimiento sincero a los Excelentísimos Académicos D. Vicente Serrano Tomé y D. Amalio de Juana Sardón, que con su aprecio y consideración han dado animo para mi presentación a la Real Academia de Ciencias Veterinarias en la que lleno de ilusiones quiero contribuir de forma eficaz como veterinario a los principales fines de la misma como son fomentar y desarrollar las Ciencias Veterinarias.

 

            No quiero dejar pasar esta ocasión de recordar a mi Profesor y Maestro, Profesor D. Félix Sánz Sánchez, Miembro Fundador de esta Academia, del que tuve la suerte de ser admitido en su Cátedra como alumno interno. Siguiendo su consejo y apoyo conseguí una beca de estudiante en el CENTRO EXPERIMENTAL DEL FRÍO del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (C.S.I.C.), y hoy Instituto del Frio y por último el honor de tenerlo de director de tesis, cuya sabiduría y sencillez siempre dejaron un imborrable recuerdo en todos los que le conocimos.

 

            Permítaseme un corto, pero no por ello menos afectuoso recuerdo hacia la persona que, desde la fundación de esta Docta Corporación, ocupó el Sillón número 1, que ahora me ha sido asignado. El Profesor D. Carlos Luis de Cuenca y González-Ocampo, de las muchas promociones de alumnos que pasaron por su catedra, de las primeras paso mi padre y yo de las últimas. Una importante historia de la Veterinaria ha sido escrita de su puño y letra o mejor, ha salido de su maquina de escribir, como reza su libro jubilar, 50 años de actividad profesional en primera linea, de la que yo quisiera destacar su inquietud por la investigación, y cuando no era posible por nuestros escasos medios, traia los investigadores relevantes a España, en sus Congresos, para no alejarnos demasiado de la ciencia de vanguardia y como muestra de su categoria internacional, basta un botón, decir que ademas de Presidente de esta Academia era miembro de 12 academias repartidas por todo el mundo, no pudiendo pensar, ni por lo más remoto, que a mí me cabría el honor de sucederle, en el Sillón de la Real Academia de Ciencias Veterinarias.

 

            A nivel mas cercano y personal, una cariñosa mención para mi familia que me han acompañado y ayudado en los momentos difíciles.

 

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TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN LECHE

 

            La leche, para ser consumida con garantías higiénico-sanitarias, necesita de un tratamiento térmico previo. La acción del calor desencadena toda una serie de modificaciones físico-químicas que van a afectar a la calidad nutricional de la leche procesada. Estas modificaciones están relacionadas con la tecnología empleada y con las combinaciones temperatura/tiempo alcanzadas.

 

            Existen muchos compuestos químicos cuya formación o destrucción están íntimamente relacionados con los procesos térmicos que se aplican a la leche. Las modificaciones que experimentan algunos de estos compuestos pueden llegar a ser un índice valido para conocer el deterioro sufrido en la leche.

 

            Los grupos de investigación, defienden un parámetro de calentamiento al que son mas afines, pero hoy en día, podríamos aventurarnos a decir que son pocos los compuestos químicos que cumplan las premisas de sensibilidad, para cualquier rango térmico, y de estabilidad durante la vida comercial de la leche.

 

            Parece ser, que la tendencia actual de la comunidad científica es la de aplicar conjuntamente varios parámetros de calentamiento y de esta forma suplir sus carencias individuales para poder llegar a catalogar con precisión las modificaciones que experimenta la leche con el calor.

 

            Uno de los índices de calentamiento mas extendidos desde su aparición en 1959, fue la determinación colorimétrica de 5-hidroximetil-furfural (HMF).

 

            En la bibliografía se recoge multitud de trabajos referentes a la formación de este compuesto químico en la leche calentada. Sin embargo, algunos de estos estudios llegan a conclusiones opuestas y valores dispares. Esto es debido, principalmente, a la metodología de análisis aplicada y no al compuesto químico en sí.

 

            Por este motivo, desde hace unos años se ha cuestionado seguir empleando el HMF como índice de calentamiento.

 

            Para avanzar en esta polémica se requiere poder determinarlo de una forma directa, sin necesidad de formar un complejo coloreado con el ácido 2-tiobarbitúrico.

 

Desarrollo y mejora de diferentes métodos analíticos.

 

            Nuestro grupo de trabajo ha desarrollado una metodología alternativa a la colorimétrica que sirve para una cuantificación directa y precisa de HMF en leche y sistemas modelo para cualquier rango de temperaturas.

 

            También hemos diseñado, construido y patentado una planta piloto tubular de calentamiento indirecto de leche a nivel de laboratorio.

 

            Otra etapa importante la constituye por una parte el estudio del comportamiento térmico del HMF y otros compuestos en diferentes sistemas de calentamiento directos e indirectos, así como el estudio de las modificaciones que experimenta la leche UHT durante los procesos de conservación hasta el límite de su vida comercial.

(Por último, se realizó un muestreo en leche comercial española para conocer los niveles medios de los diferentes parámetros de calentamiento estudiados.)

 

MÉTODO DE HMF POR HPLC.

 

            En la bibliografía, se recogen muchos trabajos relacionados con la separación cromatográfica de furfurales en diferentes alimentos. Por ejemplo, la cuantificación de estos compuestos en zumos de frutas y mieles es empleado como índice de calidad. Sin embargo, en leche solamente se tiene constancia de un método de análisis por cromatografía líquida en fase inversa.

 

            La determinación de furfurales en leche no es tan sencilla como en otros alimentos debido a que se generan gran cantidad de compuestos químicos que pueden interferir en la separación.

 

            Inicialmente, se ensayó la metodología propuesta por Boekel y Rehman pero nos encontramos, en algunas de las muestras, con contaminaciones en el pico correspondiente al HMF por dos picos adyacentes denominados por nosotros X e Y. Esta contaminación se hacia mas evidente tanto en leches que habían sufrido un calentamiento mas drástico como en leches que llevaban varias semanas en almacenamiento a temperatura ambiente.

 

            Estos compuestos desconocidos interferían en la correcta cuantificación del HMF, por lo que optamos por modificar el método cromatográfico inicial.

Se estudiaron como afectaban las siguientes variables en la separación:

            - concentración salina de la fase móvil.

            - el pH de la fase.

            - y el porcentaje de modificador orgánico empleado.

 

            Las variaciones en los tiempos de retención del HMF, expresados como el logaritmo del factor de capacidad frente a la concentración salina empleada en la fase para diferentes valores de pH comprendidos entre 3,0 a 4,5. Se puede observar, como a los valores de pH extremos no es viable la separación de HMF porque o bien, quedaba muy retenido en la columna, a altos valores de pH, o bien eluia casi con el frente, cuando el pH era mas ácido.

 

            Cuando se representa gráficamente el numero de platos teóricos alcanzados por el sistema para HMF frente a la concentración salina de la fase se obtiene un máximo de eficacia a 0,08M.

 

            Operando de igual manera, parece ser que el pH óptimo para la separación de HMF es el de 3,6. Los progresivos aumentos del pH repercuten en una pérdida de la eficacia en el sistema.

 

            De manera secundaria a lo inicialmente previsto, nos dimos cuenta que en la determinación cromatográfica de HMF también pueden separarse simultáneamente otros compuestos como el furfural y ácido levulínico, además de los dos compuestos desconocidos X e Y. Estos compuestos podrían temer un comportamiento térmicos característico.

 

            Nos propusimos comprobar si las condiciones anteriormente fijadas para la fase móvil eran también validas para separar estos compuestos. Ya que, el principal factor limitante eran los elevados tiempos de retención del furfural.

 

            Se debe encontrar el equilibrio entre una eficiente separación de los compuestos acompañantes al HMF, para cualquiera que sea su concentración, y unos tiempos mínimos de retención de furfural.

 

            Se comprobó, que las condiciones anteriormente descritas son también validas para separar el furfural. A la concentración salina de 0,08 M fue donde se alcanzaron los mayores valores de numero de platos.

 

            La misma concentración salina se obtuvo para el compuesto X.

 

            De forma paralela, se estudió el efecto de la presencia de metanol en la fase móvil sobre la retención del compuesto X, HMF, compuesto Y y furfural.

 

            La variación en el logaritmo del factor de capacidad para cada uno de los compuestos estudiados frente al porcentaje de metanol empleado en la fase móvil. Los porcentajes de metanol estudiados estaban entre el 0 y 10%, siendo el máximo empleado por otros autores en otros alimentos.

 

            Cuando los porcentajes de metanol en la mezcla eran superiores al 3% no se llegó a alcanzar en el sistema la resolución necesaria para separar eficientemente el compuesto Y del HMF.

 

            Sin embargo, empleando un 3% podemos separarlos para niveles normales de HMF en leche tratada térmicamente.

 

            Pero, si las muestras han sido sometidas a tratamientos térmicos mas drásticos el compuesto Y se engloba en el pico del HMF. En este último caso no se llega a obtener una resolución completa a línea base.

 

            Por este motivo se decidió no utilizar metanol como constituyente de la fase móvil.

 

            Del estudio desarrollado se determinó que la composición óptima de la fase móvil es la siguiente:

            - Una solución salina de acetato sódico de concentración 0,08M ajustada con ácido acético a pH 3,6.

 

            En estas condiciones el orden de elución de los compuestos es el siguiente:

            - Levulínico, Compuesto X, HMF, Compuesto Y y Furfural.

 

 

PLANTA PILOTO DE LABORATORIO.

 

            Siempre se ha trabajado con instalaciones industriales y semi-industriales, por lo que nos ha parecido importante construir una planta piloto de calentamiento indirecto a nivel de laboratorio.

 

            En esta planta experimental, la leche es calentada de manera continua a través de un sistema tubular construido en acero inoxidable y contenido en dos hornos eléctricos de temperaturas regulables.

 

            fase A, Inicialmente, la leche termostatizada, entre 30-33°C, atraviesa en el sistema impulsada por una bomba a un caudal constante de 187 mL/min.

 

            fase B. Posteriormente, la leche es calentada en dos intercambiadores de calor de potencia variable. El primer intercambiador puede alcanzar una temperatura máxima de 250°C y por ello es empleado para pre-calentar la leche entre 42 y 72°C. La función del segundo intercambiador es la de elevar la temperatura de la leche hasta la temperatura de análisis. El control de los hornos está regido por sendas unidades potencia.

 

            En la siguiente etapa, la leche es mantenida a la temperatura máxima de trabajo durante un tiempo determinado, es la etapa de mantenimiento de temperatura.

 

            A la salida la leche se encuentra a elevadas temperaturas por lo que resulta necesario un sistema de enfriamiento rápido antes de recoger la muestra. Por ello, se han conectado en serie dos circuitos de refrigeración.

 

            Además, la instalación dispone de seis sensores de temperatura del tipo PT-100 encapsulados en acero inoxidable que están conectados a un registrador central. Su misión, es el control de la temperatura en los puntos críticos de la instalación como son:

 

            - la temperatura inicial de la muestra (T1)

            - a la salida del precalentamiento (T2) y del calentamiento (T3)

            - a la salida del mantenimiento de temperatura (T4)

            - y en las sucesivas fases de enfriamiento (T5) y (T6).

 

            A continuación se pasa a exponer con algo mas de detalle los componentes principales de la instalación.

 

            La unidad de medida y potencia está compuesta por un TRIAC regulado por un potenciómetro.

 

            La función del potenciómetro es muy importante ya que controla la deriva térmica en el intercambiador de calor una vez alcanzada la temperatura deseada, estabilizandola en poco tiempo.

 

            Otro componente es el denominado regulador de temperatura, A.

            Aquí se fija la temperatura de trjo deseada, en L, y se rec la información se el calentamiento a través de un termopar, B.

 

            El tercer componente es el contactor que está conectado en serie con el regulador de temperatura y la unidad de potencia. Su misión es relacionar ambos componentes.

De esta forma, cuando la temperatura elegida es inferior a la determinada por el sensor permite al TRIAC que se envíe potencia a las resistencias en el intercambiador. También puede actuar de manera contraria, evitando un sobrecalentamiento.

 

            El intercambiador de calor, está compuesto de una resistencia eléctrica tipo Nicron (D), la cual está enrollada uniformemente, dejando 1 mm de separación, se un t cerámico de alta capacidad térmica, (E).

 

            La resistencia eléctrica se conecta por sus terminales, (F), a la unidad de medida y potencia y se fija al t por un cemento cerámico dejo contenido en hierro (C).

 

            La siguiente capa es una lana de fa cerámica (B) que tiene como misión aislar y prevenir la perdida de calor.

 

            Por último, todo el sistema esta protegido de exterior por una chapa de acero inoxide (A) de 1 mm de espesor.

 

            Por otra parte, el sistema dispone de un juego de 5 piezas intercambiables de mantenimiento de temperatura convenientemente aisladas. Cada tubo se diferencia en la longitud, donde a un caudal constante de 187 mL/min, se pueden alcanzar diferentes tiempos de calentamiento.

 

            Además, el diseño es tal, que permite acoplar varios tubos en serie dando tiempos mantenimiento de temperatura acumulativos.

 

            Las principales ventajas que ofrece esta planta son:

            - La posibilidad de trabajar con pequeños volúmenes de leche (200 mL)

            - La capacidad de alternar diferentes tiempo de residencia.

            - Alcanzar la temperatura de trabajo en un corto espacio de tiempo.

            - Ser empleada para otros productos líquidos y semi-líquidos.

 

TRATAMIENTOS TÉRMICOS.

 

            En una siguiente etapa, se abordó el estudio de los efectos de los tratamientos térmicos sobre la formación de diferentes índices de calentamiento, principalmente sobre el HMF. En este sentido se dividieron los procesos empleados en directos e indirectos.

Como tratamiento directo se utilizó una planta piloto APV de procesamiento UHT semi-industrial y como tratamientos indirectos tanto la planta piloto de laboratorio como calentamientos en baño de glicerina de pequeños volúmenes de leche y sistemas salinos (SMUF).

 

            Los estudios realizados en la planta piloto UHT-directa sirvieron de base para conocer el comportamiento térmico del HMF, tanto para la metodología colorimétrica como para la cromatográfica.

 

            Se llevaron a cabo ensayos a las temperaturas fijadas de 135°C, 142°C y 150°C y tiempos de residencia entre 2,5 y 20 segundos. Se escogieron estas condiciones de trabajo porque eran similares a las empleadas en las industrias.

 

            Un resumen de los valores medios de HMF detectados para cada combinación de temperatura y tiempo. En color amarillo se representa el HMF determinado por la metodología colorimétrica tradicional y en color rojo al HMF obtenido por la técnica cromatográfica desarrollada en esta memoria.

 

            Podemos observar como la formación de HMF aumenta proporcionalmente con la temperatura y tiempo de calentamiento, independientemente de la metodología aplicada.

 

            Por otra parte, con el análisis colorimétrico detecta una formación superior de HMF y las diferencias entre ambos métodos analíticos aumentan a mayores temperaturas.

Probablemente, esto es debido a la presencia de compuestos carbonílicos muy reactivos que forman complejos coloreados con el ácido tiobarbitúrico en la misma región del visible.

 

            Para estudiar el comportamiento térmico del HMF durante un proceso UHT se ajustaron los resultados obtenidos a una cinética de formación de orden cero.

La ecuación general correspondiente a una cinética de orden cero para un proceso de formación a una determinada temperatura.

 

            Siendo Ct la concentración de HMF a un tiempo t y Co la concentración inicial de uno de los reactantes, lactosa o lisina.

 

            Los niveles de HMF habituales en leche, en comparación con el de los reactantes, permiten tomar al valor Co como constante durante el proceso e incluirlo en la constante de reacción que ahora tendría otro significado.

 

            Una vez realizados los cálculos cinéticos se llegaron a los siguientes resultados.

Se determinó un orden de reacción cero para la formación del HMF durante el proceso UHT para ambas metodologías.

 

            Las energías de activación fueron de 124,19 KJ/mol para colorimetría y de 117,5 KJ/mol para cromatografía.

 

            También se calcularon matemáticamente los valores promedio del factor de Arrhenius, así como el coeficiente de temperatura y el valor Z.

 

             Conociendo los valores de las energías de activación y del factor de Arrhenius se puede calcular la formación teórica de HMF para cualquier tiempo de residencia en el rango de temperaturas analizado. Esto se lleva a cabo sustituyendo en la ecuación de Arrhenius la constante de velocidad de reacción.

 

            Finalmente, se analizó el contenido de HMF presente en 54 muestras de leche entera sin procesar.

 

            Para el método colorimétrico se han obtenido unos niveles medios de 4,59 μmol/L y de 1,301 μmol/L para el cromatográfico. Estos valores serán utilizados como blanco para sucesivos cálculos de HMF en muestras de leche tratadas donde no se tenga constancia de la leche cruda de partida.

 

            Se puede asu, que el valor obteo de HMF por la téca cromatográa es el generado de "novo" a partir de los precursores de la reacción tras el proceso de hidrólisis ácida, ya que la determinación cromatográfica de HMF es directa y no requiere de intermediarios coloreados.

 

            Siguiendo esta premisa, el 71,6% de la concentración de HMF detectada por colorimetría sería debida a interferencias de otros compuestos en la reacción con el TBA.

 

            Los valores de leche cruda obtenidos por ambas metodologías y se muestra la ecuación de regresión obtenida, con un factor de correlación de 0,86.

 

PLANTA PILOTO DE LABORATORIO.

 

            En la planta piloto de laboratorio se realizaron diferentes calentamientos en el rango de 96°C a 122°C, para tiempos de residencia de 1,2 a 16,2 segundos.

 

            Un procesado standard tiene una duración de 130,5 s donde la leche parte inicialmente a 30-33°C y finalmente es recogida a 20°C.

 

            Se calculó el factor de esterilización (F) de cada ensayo, sumando los factores de esterilización parciales en los 7 tramos.

 

            Se define factor de esterilización o valor F o tiempo de calentamiento equivalente, como el tiempo requerido a una temperatura teórica de referencia para ejercer el mismo daño térmico a la leche que en un proceso real.

 

            En los cálculos del valor F se han tenido en cuenta la perdida de temperatura en la etapa de mantenimiento. Estas perdidas son normales en las plantas de procesado indirecto y puede llegar a representar modificaciones importantes en el cálculo del valor F final, si no son tenidas en cuenta.

 

            Los valores de F alcanzados en los tratamientos realizados en esta planta varían entre 1,09 s y 9,96 s, dependiendo siempre de la temperatura máxima alcanzada y el tiempo de residencia.

 

            Sobre el conjunto de muestras procesadas se estudiaron los niveles de HMF y lactulosa, así como se aplicó por primera vez el método del agente clarificante.

 

            Se encontraron correlaciones significativas entre los valores de esterilización calculados y los niveles de los índices de calentamiento ensayados.

 

 

TRATAMIENTOS TÉRMICOS EN BAÑO DE GLICERINA.

 

            En una siguiente etapa se estudió el comportamiento cinético de diferentes compuestos durante calentamientos indirectos en baño de glicerina.

 

            Para este estudio se empleó tanto leche cruda entera como los diferentes simulados salinos de ultrafiltración descritos en la diapositiva. Los sistemas SMUF estaban compuestos de lactosa, caseína y proteínas de suero en proporciones similares a la leche.

Los calentamientos se realizaron a las temperaturas de 90, 120, 130 y 140°C y a los tiempos entre 150 y 1500 s, dependiendo siempre de la estabilidad de la muestra.

 

            El estudio del comportamiento cinético de cualquiera de los compuestos cuya génesis o degradación depende de los tratamientos térmicos sufridos por la leche es muy complejo debido a la existencia simultanea de reacciones entrecruzadas.

 

            Una de las principales reacciones que van a intervenir son las que involucran al carbohidrato mayoritario de la leche, como son la reacción de degradación e isomerización así como las reacciones de Maillard cuando existe presencia de restos amino en el medio.

 

            Por otra parte, también debemos prestar atención a las interacciones proteína-proteína. Todas estas reacciones pueden tener lugar de forma aislada o simultanea, complicando aún mas el estudio.

 

            Inicialmente, se estudió la formación de HMF en el sistema SMUF de lactosa tanto por colorimetría como por cromatografía.

 

            La formación de HMF en este sistema es proporcional a la temperatura y tiempo de calentamiento, y este comportamiento también lo experimenta en los demás sistemas modelo, independientemente de la metodología de análisis empleada.

 

            El HMF detectado en este sistema SMUF proviene únicamente de las reacciones de isomerización y degradación de la lactosa.

 

            En el sistema SMUF de caseína, la formación de HMF, tanto por colorimetría como por cromatografía, es similar a la detectada en el sistema SMUF de lactosa.

 

            De igual manera se comporta durante los calentamientos de leche cruda.

 

            En los sistemas que contienen proteínas, el HMF puede ser formado además por otra vía, las reacciones amino-carbonilo, entre la lactosa y los restos lisil de las proteínas. El HMF es solamente un intermediario de reacción y si las condiciones en el medio lo permiten, puede seguir reaccionando hacia la formación de melanoidinas. Esta afirmación se ve apoyada por la aparición de coloraciones pardas en los sistemas estudiados a mayores temperaturas y tiempos de calentamiento.

 

            A la vista de los resultados parece ser que el HMF se genera, principalmente desde las reacciones de isomerización y degradación de la lactosa y de manera secundaria a través de la reacción de Maillard, aunque esta última reacción parece que cobra importancia a las temperaturas mas elevadas.

 

            El cromatograma muestra la separación del HMF en el sistema SMUF de caseína. En este sistema es donde se alcanzaron los mayores niveles de formación para el compuesto X.

 

            Si tomamos al HMF como marcador del tratamiento térmico aplicado, se puede observar como la relación entre compuesto-X / HMF va disminuyendo en los cromatogramas de leche, proteínas de suero, y lactosa.

 

            La formación de compuesto X en este sistema SMUF es minoritaria y el pico cromatográfico no llega a definirse de forma clara.

 

            En este sistema tiene un comportamiento diferente al del resto, ya que es donde se alcanzaron las mayores concentraciones de HMF para cada una de las temperaturas.

 

            Este hecho podría ser explicado basándonos en la débil estabilidad térmica que presentan las proteínas de suero.

 

            La compleja estructura espacial de estas proteínas es uno de los factores que limita su estabilidad al calor. Durante los calentamientos se ha ido perdiendo progresivamente la estructura globular, de esta forma, quedan ahora expuestos al medio una serie de restos amino que antes permanecían protegidos de interaccionar con la lactosa.

 

            En este sentido se ve incrementada la Reacción de Maillard desde las temperaturas de desnaturalización, debido simplemente a un aumento en uno de los reactantes, la lisina.

 

            La leche, contiene proteínas de suero en la misma proporción que el sistema de WPC, sin embargo, no llega a alcanzar estos niveles de HMF. Este hecho puede ser explicado con las interacciones existentes entre las caseínas y las proteínas de suero que tienen lugar en la leche calentada. Gracias a ellas, los restos lisil quedan protegidos de la reacción con la lactosa por un simple impedimento estérico.

 

            Por otra parte, las diferencias entre los métodos colorimétrico y cromatográfico aumentan con la temperatura y tiempo de calentamiento.

 

            Como hemos señalado anteriormente, el ácido tiobarbitúrico no es un reactivo específico de HMF y puede reaccionar con otros grupos aldehídos generados durante el calentamiento de los diferentes sistemas, interfiriendo de esta manera en una correcta cuantificación de HMF por colorimetría. Por el contrario la determinación cromatográfica es directa y está libre de este tipo de errores.

 

            Este hecho se ve reflejado de una manera muy clara en la determinación cromatográfica de HMF en el sistema de proteínas de suero. En este sistema no se llegan a alcanzar las concentraciones de HMF detectadas por colorimetría.

 

            Tanto para la leche como los sistemas SMUF estudiados, la formación de HMF, determinado tanto por colorimetría como por cromatografía, se ajusta a una cinética de reacción de orden cero.

 

            Los valores de energías de activación obtenidos para leche son similares a los de otros autores.

 

            Por cromatografía se obtuvieron unas energías de activación de 118,57 KJ/mol en leche, 93,04 KJ/mol en el sistema SMUF de proteínas de suero, 103,5 KJ/mol en el sistema SMUF de caseínas y de 118,5 KJ/mol en el sistema SMUF de lactosa.

 

            No se tiene conocimiento de datos cinéticos anteriores en la bibliografía relativos a la determinación cromatográfica de HMF.

 

 

            También se ha estudiado la cinética de formación de ácido levulínico, en leche y en los sistemas SMUF de caseína y proteínas de suero, ya que, en contra de lo inicialmente esperado, no se detectó en el sistema SMUF de lactosa.

 

            Por este método las concentraciones de levulínico, expresadas en milimoles/L, aumentan proporcionalmente con la temperatura y tiempo de calentamiento en leche.

 

            La cinética de formación de ácido levulínico se ajusta a un orden cero tanto en leche como en los sistemas SMUF de caseína y proteínas de suero.

 

            Se obtuvieron unas energías de activación de 75,36 KJ/mol para leche, 91,03 KJ/mol para el sistema SMUF de proteínas de suero y de 69,77 KJ/mol para el sistema SMUF de caseína.

 

            La estimación del porcentaje de lisina no disponible es una buena herramienta para conocer la extensión de las etapas iniciales de la reacción de Maillard.

 

            En este trabajo se ha estudiado la degradación de lisina utilizando dos métodos fluorimétricos de gran sencillez si los comparamos con los métodos cromatográficos donde las etapas de hidrólisis retrasaban demasiado los análisis. Los métodos descritos en esta memoria están concebidos para ser empleados rutinariamente y emplean tanto fluorescamina como reactivo OPA como agentes fluorófobos.

 

            Los resultados obtenidos son totalmente comparables por ambos métodos. Los mayores porcentajes de bloqueo de lisina se determinaron en el sistema SMUF de proteínas de suero, estando en relación estos resultados con los mayores niveles de HMF detectados en ese sistema.

 

            En la leche fue donde se registraron las perdidas menores de lisina tanto para el reactivo OPA como para fluorescamina. Esto es debido a las interacciones proteína-proteína que impiden estericamente la formación de lactulosil-lisina.

 

            Para el estudio cinético se emplearon las ecuaciones abajo descritas.

 

            La cinética de destrucción de lisina en leche y sistemas SMUF se ajusta a un segundo orden.

 

            Las energías de activación obtenidas, empleando como reactivo la fluorescamina, fueron de 69,77 KJ/mol para leche, 105,13 KJ/mol para el sistema SMUF de proteínas de suero y de 94,55 KJ/mol para el sistema SMUF de caseína.

 

            Utilizando el reactivo OPA como marcador de restos lisil se obtuvieron energías de activación similares.

 

            Para la determinación de lactulosa se ha utilizado una modificación al método espectrofotométrico descrito por Adhikari.

 

            El principio del método está basado en el hecho de que las cetosas son descompuestas más fácilmente que las aldosas por la acción de ácidos minerales.

 

            Como la leche calentada no contiene más cetosas que la lactulosa en cantidades significativas, el principio aplicado en este método es específico para la determinación de lactulosa.

 

            En la diapositiva se representa como es pequeña la interferencia de una solución del 5% de lactosa en el método.

 

            Sin embargo, este método no puede ser aplicado sobre cualquier sustrato ya que presenta algunas limitaciones, en este sentido estamos en desacuerdo con el autor.

 

            Empleando esta metodología fue imposible determinar, con un margen de error aceptable, la formación de lactulosa en los sistemas SMUF de lactosa, caseína y WPC.

 

            En cambio, si se pudo determinar en leche. En la gráfica se representa la formación de lactulosa para las condiciones estudiadas.

 

            La cinética de formación de lactulosa en leche se ajusta a un orden uno con una energía de activación de 113,53 KJ/mol.

 

            Desde hace algunos años ha aparecido un método rápido para diferenciar leches tratadas térmicamente. El método está basado en la medida de absorción a 340 nm de una solución de leche clarificada.

 

            En leche fue donde se obtuvieron los mayores valores de absorbancia para del índice del agente clarificante. En los sistemas SMUF de caseína y WPC se obtienen valores similares.

 

            La evolución del índice del agente clarificante se ajusta a una cinética de formación de orden cero. Con energías de activación de 70,10 KJ/mol para leche, 101,56 KJ/mol para proteínas de suero y de 101,29 KJ/mol para el sistema SMUF de caseína.

 

            Tampoco se tenía conocimiento de anteriores citas bibliográficas relativas a la cinética de ácido levulínico.

 

            La determinación de intermediarios fluorescentes nos da idea de la extensión de las etapas finales de la reacción de Maillard, la formación de polímeros pardos.

 

            Se registraron niveles mínimos, pero detectables, de fluorescencia en el sistema SMUF de lactosa. Esto parece una contradicción, pero la fluorescencia desarrollada en sistemas en ausencia de grupos amino tiene una génesis diferente y por ello unos máximos de absorción y emisión característicos.

 

            Los niveles máximos de fluorescencia, medidos como % de fluorescencia relativa, se obtuvieron en leche.

 

            La acumulación de fluorescencia es proporcional a las condiciones de calentamiento empleadas.

 

            La cinética de formación de intermediarios fluorescentes en leche y sistemas SMUF de caseína y proteínas de suero se ajusta a un orden cero.

 

            Sin embargo, el comportamiento cinético del desarrollo de fluorescencia en el sistema SMUF de lactosa se ajustaba mejor a un primer orden.

 

EFECTOS DE LA CONSERVACIÓN EN LECHES UHT.

 

            En una siguiente etapa se estudiaron las variaciones en los niveles de HMF sobre cuatro muestras de leche UHT conservadas durante 90 días a las temperaturas de 6, 20, 30, 40 y 50°C.

 

            Se realizaron para este estudio, los diagramas de temperatura y tiempo para cada una de las instalaciones industriales estudiadas. Las plantas I y II corresponden a un procesado UHT indirecto y las III y IV a uno directo.

 

            El perfil de calentamiento del proceso nos puede dar una idea aproximada de la severidad del tratamiento térmico aplicado a la leche. Pero, integrando el área de la curva obtenemos un valor con el que podremos comparar procesos térmicos totalmente diferentes.

 

            Algunos autores se limitan a calcular el daño térmico del proceso solamente en el área que cubre la temperatura de esterilización.

 

            En los tratamientos indirectos, donde las etapas de enfriamiento y pre-calentamiento son importantes, obviar este cálculo puede ser causa de un error grave en el cálculo final del valor de F.

 

            Los valores mayores de F corresponden a las muestras I y II. Esto es debido fundamentalmente a la tecnología empleada. En los tratamientos directos alcanzar la temperatura de esterilización es un paso casi instantáneo y en cambio en los sistemas con tratamiento indirecto este paso resulta mas progresivo.

 

            En todas las muestras se observó un comportamiento similar del HMF, determinado tanto por colorimetría como por cromatografía, durante la conservación.

 

            La formación de HMF depende de la temperatura de almacenamiento. Solamente se observó una formación neta de HMF a las temperaturas superiores a 30°C. A la temperatura de 20°C parece ser que existe un equilibrio entre los procesos de formación y destrucción de HMF.

 

            También, la formación de HMF parece ser que depende del tiempo de almacenamiento porque, aproximadamente, a los 60 días y a las temperaturas de 30 y 40°C, se observó una perdida de linearidad en todas las muestras.

 

            Por otra parte, parece ser que la formación neta de HMF durante el almacenamiento para las temperaturas de 30°C, 40°C y 50°C es mayor cuanto menor es el valor de F del proceso. Es decir, en las muestras con tratamiento UHT directo, existe una formación neta superior de HMF que en las UHT indirectas.

 

            La cinética de formación de HMF durante la conservación de leche UHT hasta límite de vida comercial se ajusta a un orden cero, tanto para la determinación colorimétrica como para la cromatográfica.

 

            No se conocían con anterioridad datos bibliográficos relativos a cálculos de energías de activación de HMF determinado por cromatografía para un proceso de conservación de leche UHT comercial.

 

ANÁLISIS DE LECHES COMERCIALES.

 

            Con la finalidad de conocer la realidad comercial en nuestro país se han estudiado los niveles de diferentes compuestos en muestras de leche comercial española. El estudio se ha centrado en leche UHT aunque también se han analizado pasteurizadas y estériles.

 

            El valor medio de HMF para leche UHT fue de 5,160 μmol/L para cromatografía y de 8,07 para colorimetría.

 

            El 53% de las muestras UHT analizadas se encuentran comprendidas en el rango de 3,6-6,0 para cromatografía, mientras que el 61% de colorimetría está en el rango de 6,0 a 9,6.

 

            En todas las muestras estudiadas se detectó la presencia del compuesto desconocido X.

 

            El valor medio encontrado fue de 8,869 unidades de área.

 

            La presencia de ácido levulínico en leche es muy constante, donde todas las muestras se encuentran entre concentraciones de 1 a 3mM.

El 55,5% de las muestras UHT se incluye en el rango de 1,8 a 2,4 mM.

 

            De igual forma a lo que ocurre con el levulínico, no se conocen referencias bibliográficas relativas al contenido en furfural de leche comercial.

 

            El valor medio encontrado fue de 2,02 μmol/L y el 78% de las muestras tienen concentraciones entre 1,5 y 3 μmol/L.

 

            Las concentraciones relativas de cada uno de los compuestos experimentan un aumento en la leche UHT. Respecto al compuesto Y no se detectó en el 5,5% de las muestras analizadas.

 

            Se obtiene un valor medio de bloqueo del 2,4% para fluorescamina y del 2,3% para OPA.

 

            Estos porcentajes pueden aumentar en las muestras de leche estéril analizadas a un 5,7% para fluorescamina y un 5,8% para OPA.

 

            También se analizó la presencia de lactulosa por el método espectrofotométrico.

La concentración media de lactulosa encontrada en leche UHT española fue de 42,63 mg/100mL.

 

            Según la Federación Internacional de Lechería el límite máximo admisible es de 60 mg/100mL.

 

            En este caso, el 17% de las muestras estarían sobreprocesadas, incluso, se detectó una muestra con niveles superiores a 80 mg/100mL.

 

            También se analizaron los niveles del índice del agente clarificante. El valor medio detectado fue de 0,125 unidades de absorbancia.

 

            La FIL propone como valores medios para el tratamiento UHT unos niveles mínimos de ß-lactoglobulina no desnaturalizada de 20 mg/100mL.

 

            Esta condición no es cumplida por el 47,2% de las muestras, de las cuales el 47,0% tiene niveles inferiores a 6 mg/100mL.

 

            El contenido medio de ß-lactoglobulina en leche UHT fue de 26,2 mg/100mL.

 

            Los niveles de estas proteínas van a descender en leche UHT, desapareciendo la BSA.

 

            Para un proceso de esterilización clásica la totalidad de las proteínas de suero se encuentran desnaturalizadas.

 

            Mediante análisis de regresión lineal se determinó la relación entre todas las variables estudiadas en las muestras de leche UHT.

 

            No se encontraron relaciones significativas entre el compuesto Y, acido levulínico y furfural con ninguna de las otras variables. La formación de estos compuestos químicos en leche UHT no es constante y dependen de otros factores, además del tratamiento térmico.

 

            Por otra parte, hay que señalar que los niveles de levulínico y el valor de pH estaba relacionados entre si con un factor de correlación de 0,5, sin embargo no se encontraron relaciones significativas entre el contenido de lactulosa y valor de pH.

 

            Los valores de los índices de correlación mejoran significativamente si se incluyen en el estudio las muestras pasteurizadas y esterilizadas.

 

 

 

CONCLUSIONES

 

Los resultados obtenidos en nuestros estudios se han realizado a tres niveles : Industrial, en empresas españolas y alemanas; en planta piloto en una instalación de la firma APV de tratamiento directo e indirecto de leche del Instituto de Fermentaciones Industriales del CSIC en Arganda del Rey y a nivel de laboratorio en una planta de tratamiento indirecto de leche en continuo, diseñada en nuestro laboratorio y protegida con una patente de invención.

 

Se ha descrito un método de cromatografía líquida de alta eficacia de determinación de HMF más rápido que el colorimétrico tradicional, que además de determinar furfural y acido levulínico se obtienen dos compuestos desconocidos que hemos denominado X e Y y se encuentran en fase de identificación.

 

La formación del este compuesto X se relaciona con ciertos niveles de HMF, índice del agente clarificante, ciertos niveles de intermediarios fluorescentes y contenidos en lactulosa y de forma inversa con el contenido en proteínas de suero desnaturalizadas, lisina biológicamente disponible y el índice de proteólisis.

 

Se ha comprobado que el valor medio de HMF en leche cruda española es de 4,59 micromoles por litro en la determinación colorimétrica tradicional y de 1,30 micromoles por litro en el método cromatográfico.

 

La leche UHT comercial tiene un valor medio de furfural de 2,02 micromoles por litro.

 

Se puede clasificar la leche por su contenido en HMF determinado por cromatografía en: 

            leche pasteurizada = 1,110

            leche UHT          = 5,160

            y leche estéril    = 9,546 micromoles por litro.

 

            La cinética de formación de HMF total tiene una energía de activación de 124,2 kJ mol. para la metodología colorimétrica y 117,5 kJ mol. para la cromatográfica, // para un tratamiento de 135º a 150ºC entre 2,5 y 20 segundos.

 

            Se ha determinado la cinética de formación del ácido levulínico en leche, ajustandose a una reación de orden cero y con una energía de activación  de 75,3 kJ mol. en rangos de calentamiento de 90º a 140ºC.

 

            Para la lactulosa determinada por espectrofotometría se ha obtenido una energía de activación de 113 kJ mol. para una cinética de primer orden.

 

            El porcentaje medio de destrucción de lisina biológicamente disponible es del 5,75% del inicial.

 

            En leche UHT comercial, la presencia media de lactulosa es de 42,63 mg/100ml. y el contenido en beta-lactoglobulina es de 26,2 mg/100ml.

 

            La formación de galactosa durante el tratamiento térmico en leche presenta dos fases con energías de activación diferentes.

 

                         una energía de activación entre 90º y 120ºC de 25,44 kJ/mol

                        y otra entre 120º y 150ºC de 100,17 kJ/mol.

 

            La determinación de galactosa sirve como índice de calentamiento para todos los procesos entre 80º y 150ºC de temperatura y tiempos entre 1 y 100 segundos, pudiendose clasificar también la leche en:

 

                        pasteurizada menos de 0,25 mg/100 ml de leche

                        UHT entre 0,25 y 5 mg /100ml.

                        y estéril mas de 50 mg/100 mal de leche.

 

            La formación de grupos sulfhidrilo (SH) tiene una cinética de orden 1,7 con una energía de activación de 151,171 kJ/mol. Los grupos sulfhidrilo libres son capaces de proteger la oxidación de la vitamina C de la leche. Esta formación se encuentra estrechamente ligada a la desnaturalización por calor de proteínas del suero.

 

            Las proteínas del suero se desnaturalizan por acción del calor siguiendo una cinética de 2º orden y le corresponden unas energías de activación de:

 

                        343,30 kJ/mol entre 70º y 95ºC

                        y de 33,31 entre 95º y 150ºC

 

Por último el proceso de desnaturalización de proteínas del suero de leche se desarrolla en dos fases diferenciadas, debido al cambio de formación sufrido por la beta-lactoglobulina.

 

 

 

CONCLUSIÓN FINAL

 

            Todos los estudios sobre alteraciones de los componentes de la leche por tratamientos térmicos empezaron con un parámetro máximo de calentamiento como índice de desaparición de Vitamina B6 y un mínimo de destrucción del Bacillus stearothermophillus. Actualmente se han ampliado estos parámetros  a los antes mencionados en esta lectura, que han servido para mejora de la calidad y eficacia de los tratamientos térmicos en leche y continuará con el estudio e identificación de compuestos desconocidos de la reacción de Maillard y se completará con el tratamiento etiológico de enfermedades de origen hepático.

 

            He dicho

 

             

            DISCURSO DE CONTESTACIÓN DEL

            EXCMO. SR. D. RAFAEL JURADO COUTO

 

 

            Conocimos al Doctor Jiménez Pérez, hace alrededor de treinta años, cuando estudiando él los últimos cursos  de la Licenciatura de Veterinaria, en esta Facultad, se aproximó a la cátedra de Farmacología y Toxicología para aprender algo de la mucha investigación que sabía Don Félix. Allí estuvo poco tiempo, ya que visto por mi maestro sus aptitudes y preferencias, le apadrinó para que acudiera al Centro Experimental del Frío, para que se fuera formando al lado de algunos de sus antiguos discípulos D. Rafael Pozo Fernández, D Eugenio García Matamoros (antiguos académicos ya fallecidos), D. Ángel Goicoechea y D. Antonio Moral Rama.

 

            La finalidad de dicha decisión es que el centro citado era y es un magnifico crisol pluriprofesional de investigadores, puesto que en él conviven y trabajan biólogos, veterinarios, ingenieros de diversas ramas, químicos, etc. y tan acertada fue que es donde el recipiendario ha desarrollado su labor investigadora y profesional desde 1969 hasta hoy  excepto tres años que ha estado becado en el Instituto de Tecnología Láctea de Kiel (Alemania).

 

            En el Instituto del Frío, que es como se denomina hoy, el Dr. Jiménez Pérez ha ocupado los puestos de Becario, Colaborador Científico e Investigador Científico, todo ello dentro del Conse

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	Nombre	Fecha de publicación	Precio
	Alteraciones de los componentes de la leche por tratamientos térmicos	1995-10-25	Gratuito

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